本文關(guān)鍵詞：蜂膠渣抑制桑青枯菌成分咖啡酸酯類化合物的酶促合成與生物活性　出處：《江蘇科技大學(xué)》2017年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

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【摘要】：桑樹青枯病是由青枯勞爾氏菌(Ralstonia solanacearum,簡(jiǎn)稱青枯菌)引起的一種植物細(xì)菌病,具有發(fā)病急、蔓延迅速、危害嚴(yán)重、防治困難等特點(diǎn),屬于對(duì)蠶業(yè)生產(chǎn)毀滅性危害的重要桑樹病害之一。當(dāng)前,桑青枯病的防治措施使用的藥劑多為化學(xué)農(nóng)藥,毒性較大,污染環(huán)境,有的已經(jīng)禁用,因此急需尋找毒性較小、環(huán)境友好和成本可控的新型生物農(nóng)藥制劑。自古以來,蜂膠的抗菌效果得到公認(rèn),是蜂巢防病治蟲這一天然防御系統(tǒng)的重要組成部分。目前,市場(chǎng)上的蜂膠保健食品常以總黃酮含量作為產(chǎn)品質(zhì)量評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn),因而蜂膠制品的工業(yè)化生產(chǎn)主要是提取其黃酮類成分,而具有抗菌活性的咖啡酸及其酯類衍生物則殘留在大量的蜂膠渣中,若加以利用開發(fā)天然來源的農(nóng)藥制劑,則會(huì)變廢為寶,既節(jié)約了成本,又保護(hù)了環(huán)境,符合國(guó)家實(shí)施綠色植保戰(zhàn)略要求,具有重要的學(xué)術(shù)意義和經(jīng)濟(jì)價(jià)值。因此,本課題擬從蜂膠渣中篩選出抑制青枯菌活性強(qiáng)的咖啡酸酯類單體,構(gòu)建新型雙液相酶促合成新工藝,比較分析敏感差異的病原菌全基因組,并探究對(duì)桑葉重要害蟲及天敵的影響。主要研究?jī)?nèi)容及結(jié)論如下:(1)為尋找蜂膠渣中所含的抑菌活性成分,基于活性追蹤法,評(píng)價(jià)蜂膠渣按照溶劑極性制備的分級(jí)提取物對(duì)青枯菌五個(gè)生理小種的抑制效果,采用液質(zhì)聯(lián)用(LC-MS)技術(shù)對(duì)其含有的咖啡酸及其酯類化合物作定性定量分析,并結(jié)合藥效進(jìn)一步篩選出高活性單體化合物。結(jié)果表明,蜂膠渣的甲醇、乙醇、氯仿、乙酸乙酯以及石油醚等提取物對(duì)青枯菌的五個(gè)小種均有一定的抑菌活性,其中乙醇提取物活性高于其他。0.1 mg/mL的除蠟蜂膠渣乙醇提取物對(duì)桑樹青枯病病原菌RS-5的抑菌率達(dá)91.61±4.75%。對(duì)蜂膠渣乙醇提取物應(yīng)用ESI-LC-MS技術(shù),采用全掃描模式鑒別了咖啡酸及5種咖啡酸酯類化合物,采用選擇性反應(yīng)監(jiān)測(cè)(Selective Reaction Monitor,SRM)模式基于特征離子對(duì)測(cè)定了咖啡酸和咖啡酸苯乙酯的含量。從咖啡酸及其6種酯類單體化合物中篩出MC(Methyl caffeate,MC)和咖啡酸苯乙酯(Caffeic acid phenethyl ester,CAPE)兩種單體,EC50值分別為310.0-1225.0μg/mL和165.2-752.7μg/m L,對(duì)病原菌的細(xì)胞產(chǎn)生了變形、破損等嚴(yán)重傷害,對(duì)其泳動(dòng)性和形成生物膜等病原傳播特性造成了極大控制,是潛在的桑青枯菌抑制劑,為研發(fā)天然來源的桑樹青枯病防控藥劑提供了新的思路。(2)為提高底物溶解度和合成效率,應(yīng)用雙相催化的原理,通過添加氧膦類絡(luò)合劑營(yíng)造可逆的絡(luò)合萃取效應(yīng),首次構(gòu)建“TOPO-環(huán)己烷/[Bmim][Tf_2N]”體系,以強(qiáng)化脂肪酶催化MC與2-苯乙醇發(fā)生酯交換合成抑菌活性單體CAPE,解析絡(luò)合萃取強(qiáng)化酶促反應(yīng)分離耦合的過程機(jī)理,為高效生物合成咖啡酸酯類衍生物提供新工藝;為監(jiān)測(cè)連續(xù)流酶催化轉(zhuǎn)酯化合成過程中的底物MC和產(chǎn)物CAPE,實(shí)時(shí)表征連續(xù)流酶催化的反應(yīng)動(dòng)力學(xué)參數(shù),采用新型離子源的實(shí)時(shí)直接分析質(zhì)譜技術(shù)(Direct Analysis in Real Time-Mass,DART-MS)建立了一種快速簡(jiǎn)便的定量新方法。結(jié)果表明,三正辛基氧膦(Trioctylphosphine oxide,TOPO)為絡(luò)合劑,對(duì)MC和CAPE等咖啡酸酯類單體具有高選擇性的可逆絡(luò)合反應(yīng)特性,構(gòu)建的TOPO-環(huán)己烷/[Bmim][Tf_2N](1:1,v/v)雙相體系適用于Novozym 435催化酯交換反應(yīng)合成CAPE。通過響應(yīng)曲面分析法獲得最優(yōu)工藝條件,即在25 g/L TOPO-環(huán)己烷/[Bmim][Tf_2N](1:1,v/v)中,MC濃度為10 g/L、2-苯乙醇與MC的摩爾比為20:1、反應(yīng)溫度為76℃、TOPO濃度為25 g/L、時(shí)間為59 h時(shí),MC的轉(zhuǎn)化率為98.83±0.76%,CAPE的得率為96.29±0.07%。其中,最適底物濃度提高了3.33倍;單位底物的催化劑用量減少了77.8%,降低了工藝成本。通過化學(xué)計(jì)量計(jì)算、紅外光譜和酶動(dòng)力學(xué)分析,證實(shí)TOPO和咖啡酸酯類單體之間的可逆性氫鍵締合效應(yīng)顯著增強(qiáng)了反應(yīng)分離耦合對(duì)脂肪酶催化反應(yīng)的協(xié)同作用。選擇負(fù)離子模式,通過優(yōu)化DART離子源的操作參數(shù)提高了檢測(cè)靈敏度,獲得了高質(zhì)量的質(zhì)譜,成功建立了生物催化體系中咖啡酸酯類組分的DART-MS檢測(cè)新方法,反應(yīng)物直接檢測(cè),無需純化。使用DART-MS2測(cè)定由MC(母離子m/z 192.87和子離子m/z 133.44)和CAPE(母離子m/z 282.93和子離子m/z 178.87)產(chǎn)生的特定離子,根據(jù)SRM信號(hào)的峰面積,外標(biāo)法計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)曲線。在3.125~50 mg/L范圍內(nèi)獲得MC和CAPE的線性回歸方程,相關(guān)系數(shù)(R2)分別為0.9515和0.9973,檢測(cè)限分別為0.005 mg/L和0.003 mg/L,定量限分別為0.02和0.01 mg/L,回收率范圍分別為92.50-97.11%和90.11-97.60%。使用DART-MS分析每個(gè)樣品約40秒,結(jié)果與常規(guī)高效液相色譜法一致,成功用于測(cè)定連續(xù)流填充床微反應(yīng)器中酶反應(yīng)動(dòng)力學(xué)常數(shù)和質(zhì)量傳遞系數(shù)。因此,雙相體系為強(qiáng)化酶促合成CAPE提供了新介質(zhì),DART-MS為微流控生物催化動(dòng)力學(xué)表征提供了新手段。(3)為揭示青枯菌2個(gè)生理小種(GIM1.71和RS-5)對(duì)MC和CAPE的敏感性差異,利用比較基因組學(xué)的方法分析兩個(gè)小種間基因組結(jié)構(gòu)的差異,尋找可能導(dǎo)致耐藥性變化的特有基因,或序列結(jié)構(gòu)發(fā)生變化的共有基因。采用目前最新的第三代測(cè)序技術(shù),對(duì)GIM1.71和RS-5進(jìn)行了全基因組測(cè)序,分別獲得約3.8M的全基因組序列以及所包含的質(zhì)粒序列。通過生物信息學(xué)方法對(duì)基因組中的編碼基因、重復(fù)序列和非編碼RNA進(jìn)行了全面的注釋,共得到約5200編碼基因和約70個(gè)非編碼RNA(包括sRNA和tRNA)。通過與Gene Ontology數(shù)據(jù)庫(kù)的比對(duì),對(duì)編碼基因的功能進(jìn)行了注釋。通過KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)注釋,對(duì)編碼基因參與的生物學(xué)通路進(jìn)行了分析。通過對(duì)GIM1.71、RS-5和已報(bào)道GMI1000三個(gè)小種的比較,除三者共有的3833個(gè)基因外,共找到390個(gè)GIM1.71特有的基因和76個(gè)RS-5與GMI1000共有而GIM1.71缺失的基因。通過SNP、插入-缺失和基因組結(jié)構(gòu)變異分析,在GIM1.71和RS-5基因組中,識(shí)別到了33,697個(gè)和44,368個(gè)SNP位點(diǎn);對(duì)于三個(gè)小種共有基因,識(shí)別到了106個(gè)基因僅在GIM1.71小種中發(fā)生了小片段插入-缺失。這些發(fā)現(xiàn)將有助于揭示GIM1.71和RS-5之間對(duì)咖啡酸酯類單體敏感性的差異,為進(jìn)一步的深入分析提供了候選目標(biāo)。(4)為探究MC對(duì)桑葉重要害蟲的抑制作用及天敵營(yíng)養(yǎng)級(jí)的影響,評(píng)價(jià)其作為桑葉害蟲新型害蟲抑制劑的開發(fā)潛能,測(cè)定了MC對(duì)斜紋夜蛾、桑螟和斑痣懸繭蜂適合度指標(biāo)的影響。結(jié)果表明,1.0%和2.0%的MC對(duì)斜紋夜蛾和桑螟幼蟲均具有顯著的拒食作用,且斜紋夜蛾2齡幼蟲對(duì)1.0%和0.1%的MC溶液均存在取食選擇性。連續(xù)飼喂含2.0%MC的桑葉后,斜紋夜蛾幼蟲體重增長(zhǎng)顯著放緩,而取食含1.0%和2.0%的MC的桑葉7 d后,桑螟體重僅為對(duì)照組的37.67%和30.00%。隨著MC濃度的升高,斜紋夜蛾和桑螟幼蟲的存活時(shí)間均顯著縮短,取食2.0%MC溶液后,兩者存活時(shí)間分別比對(duì)照組縮短了24.6%和57.38%。MC對(duì)斜紋夜蛾幼蟲化蛹率無顯著影響,但在1.0%和2.0%濃度下斜紋夜蛾羽化率顯著下降;取食1.0%和2.0%的MC后,桑螟化蛹率分別比對(duì)照組下降了60.94%和53.25%,羽化率也隨之下降。斑痣懸繭蜂寄生取食不同濃度MC的斜紋夜蛾后,子代壽命、子代體型大小等重要的適合度指標(biāo)均無顯著變化,僅在2.0%濃度處理下出繭數(shù)下降、子代蜂發(fā)育時(shí)間延長(zhǎng)。因此,MC在三層營(yíng)養(yǎng)級(jí)關(guān)系中,對(duì)害蟲的抑制作用較大,對(duì)寄生性天敵的安全性較高。綜上,本文率先對(duì)蜂膠渣咖啡酸及其酯類衍生物開展分級(jí)提取、酶促合成單體、病原菌基因組比較以及對(duì)桑園昆蟲及天敵的影響研究,以期為今后研制桑樹青枯病新型藥劑提供潛在的前體化合物,為蜂膠渣的綜合利用拓展新的思路。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：江蘇科技大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：TQ458;S888.7

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