發(fā)布時(shí)間：2018-01-04 13:28

  本文關(guān)鍵詞：食品及飼料中黃曲霉毒素的快速免疫檢測(cè)試劑盒研究　出處：《北京科技大學(xué)》2017年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

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【摘要】：黃曲霉毒素是一類由黃曲霉菌和寄生曲霉菌產(chǎn)生的有毒代謝產(chǎn)物,這類毒素毒性大,致癌能力強(qiáng),理化性質(zhì)穩(wěn)定,污染廣泛,即使是在現(xiàn)有先進(jìn)的農(nóng)業(yè)技術(shù)和食品加工工藝的條件下,仍然無法完全避免和消除黃曲霉毒素污染。農(nóng)產(chǎn)品黃曲霉毒素污染已成為嚴(yán)重威脅我國(guó)大眾健康的重大風(fēng)險(xiǎn)隱患,并且已經(jīng)給我國(guó)經(jīng)濟(jì)造成了巨大的損失。因此,研究建立靈敏、準(zhǔn)確、快速、便捷的黃曲霉毒素檢測(cè)產(chǎn)品,為食品安全控制提供關(guān)鍵技術(shù)支持,具有廣闊的應(yīng)用前景和重要的現(xiàn)實(shí)意義。目前已有的黃曲霉毒素的儀器分析方法專業(yè)性要求高、時(shí)間長(zhǎng)、設(shè)備昂貴,嚴(yán)重影響了黃曲霉毒素污染監(jiān)測(cè)工作的開展。酶聯(lián)免疫試劑盒和免疫檢測(cè)試紙條由于具有使用方便、不需要昂貴設(shè)備、成本低廉的特點(diǎn)而在實(shí)際應(yīng)用中受到廣泛歡迎,但是目前現(xiàn)有產(chǎn)品的使用方便性、靈敏度等無法完全滿足市場(chǎng)日益嚴(yán)格的要求。隨著人們對(duì)食品安全要求的日益提高,研發(fā)靈敏度高、準(zhǔn)確性好、簡(jiǎn)單易操作的黃曲霉毒素免疫快速檢測(cè)技術(shù)和產(chǎn)品,對(duì)于保障農(nóng)產(chǎn)品和食品安全、促進(jìn)農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)發(fā)展、破解貿(mào)易技術(shù)壁壘均具有重要的意義。本研究針對(duì)以上問題,研制出了針對(duì)黃曲霉毒素B_1(Aflatoxin B_1, AFB_1)、黃曲霉毒素M_1(Aflatoxin M_1,AFM_1)的單克隆抗體,并以此為基礎(chǔ),建立了針對(duì)食品、飼料及乳制品中黃曲霉毒素的快速檢測(cè)方法,研制了配套的黃曲霉毒素酶聯(lián)免疫試劑盒和免疫檢測(cè)試紙條,為黃曲霉毒素污染的監(jiān)控提供了靈敏、準(zhǔn)確、簡(jiǎn)單、易操作、快速的檢測(cè)手段。本文的主要研究?jī)?nèi)容和創(chuàng)新點(diǎn)如下：1.合成了AFB_1-BSA完全抗原,抗原中AFB_1與BSA分子的偶聯(lián)比為14.5：1。利用抗原研制成功了可分泌抗AFB_1特異性抗體的細(xì)胞株2A4。抗體的親和常數(shù)高達(dá)7.9×10~9L/mol,并且2A4分泌的是針對(duì)AFB_1的特異性抗體,與國(guó)內(nèi)外所報(bào)道的抗AFB_1的單克隆抗體進(jìn)行了比較,該抗體靈敏度高、特異性好。2.通過優(yōu)化包被緩沖體系、反應(yīng)pH值、AFB_1單克隆抗體包被濃度等試劑盒參數(shù),研制成功了高靈敏度AFB_1 ELISA檢測(cè)試劑盒,該試劑盒的最低檢測(cè)限(IC_(10))為7.6 pg/mL,IC_(50)為66 pg/mL,線性范圍為10～810 pg/mL,靈敏度與文獻(xiàn)報(bào)道相比,具有顯著提升。利用試劑盒對(duì)多種樣品進(jìn)行了加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn),玉米、豆粕及魚粉的AFB1添加回收率在108.4%～134.8%之間,批內(nèi)相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差≤12.8%,批間相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差≤11.6%。試劑盒檢測(cè)結(jié)果與HPLC-MS/MS結(jié)果相符。該試劑盒可以用于對(duì)糧食或飼料樣品中黃曲霉毒素B1殘留的檢測(cè)。3.通過優(yōu)化ELISA的反應(yīng)模式、抗原抗體用量、樣品提取液等試劑盒參數(shù),研制成功了能檢測(cè)嬰幼兒食品中AFB_1的高靈敏度ELISA試劑盒,該試劑盒的最低檢測(cè)限(IC_(10))為5.5 pg/mL, IC_(50)為24.0 pg/mL,線性范圍為5～100 pg/mL。利用該試劑盒對(duì)多種嬰幼兒輔助性食品進(jìn)行了加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn),嬰幼兒營(yíng)養(yǎng)米粉、豆粉及豆面的AFB_1添加回收率在84.1%～95.2%之間,批內(nèi)相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差≤9.3%,批間相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差≤7.4%。該試劑盒對(duì)實(shí)際樣品中AFB,的檢測(cè)能力不僅滿足國(guó)內(nèi)限量標(biāo)準(zhǔn)要求,同時(shí)也能滿足更嚴(yán)格的歐盟限量要求。4.傳統(tǒng)植物油中黃曲霉毒素B_1的檢測(cè)必須經(jīng)過萃取、凈化等樣品前處理過程,操作復(fù)雜且需要消耗大量有機(jī)溶劑。本文建立了一種可直接檢測(cè)油中AFB_1的“綠色”免疫層析方法。以免疫層析試紙條為基礎(chǔ),按一定比例混合植物油和純凈水,然后用檢測(cè)卡進(jìn)行檢測(cè),就可以方便的通過肉眼確認(rèn)油中的AFB_1含量。使用該方法檢測(cè)植物油中AFB_1的含量,最低檢測(cè)限可達(dá)1.5 μg/kg,并且通過改變水油比就可符合不同的AFB_1限量標(biāo)準(zhǔn)。通過與國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行比較,驗(yàn)證了方法的準(zhǔn)確性。與此同時(shí),因?yàn)榉椒ú僮骱?jiǎn)單,不需要有機(jī)溶劑,即使沒有經(jīng)過專業(yè)訓(xùn)練的人也能操作。因此,該方法不僅可用于實(shí)驗(yàn)室中AFB_1檢測(cè)也可用于家庭中植物油安全檢測(cè),具有廣闊的應(yīng)用前景。5.通過合成AFM_1-BSA完全抗原并免疫小鼠,獲得一株可分泌抗AFM_1抗體的細(xì)胞株2F12�？贵w的親和常數(shù)高達(dá)1.8×10~9L/mol,與AFB_1交叉率為40%。通過優(yōu)化抗體包被濃度、酶標(biāo)抗原濃度、標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液等試劑盒參數(shù),研制成功了能同時(shí)檢測(cè)液態(tài)奶、酸奶和奶粉中AFM_1和AFB_1總量的ELISA試劑盒,該試劑盒的最低檢測(cè)限(IC_(10))為37pg/mL,IC_(50)為211 pg/mL,線性范圍為50～1500 pg/mL,對(duì)AFM_1和AFB_1的交叉反應(yīng)率分別為100%和102%,對(duì)其它黃曲霉毒素的交叉反應(yīng)率小于20%。利用建立的試劑盒對(duì)多種樣品進(jìn)行了加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn),回收率在87.9%～109.1%之間,批內(nèi)相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差在3.9%～10.8%之間,批間相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差≤11.1%。多次對(duì)比試驗(yàn)表明,試劑盒的檢測(cè)結(jié)果與進(jìn)口試劑盒相當(dāng)。
[Abstract]:This paper has developed a sensitive , accurate , quick and convenient method for the detection of aflatoxin in China , which has a wide application prospect and practical significance . A high sensitivity ELISA kit for detecting aflatoxin B1 in food or feed samples was developed by using the kit . The detection limit of the kit ( IC _ ( 10 )) was 5.5 pg / mL , IC _ ( 50 ) was 24 . 0 pg / mL , the linear range was 10 ~ 810 pg / mL . A new ELISA kit for detecting the total amount of AFM _ 1 and AFB1 in liquid milk , yogurt and milk powder was developed . The results showed that the relative standard deviation was between 3.9 % ~ 109 . 1 % , the relative standard deviation was between 3.9 % ~ 100.8 % , and the relative standard deviation was 鈮，

本文編號(hào)：1378721