本文關鍵詞：混合模式層析和擴張床吸附分離重組人血白蛋白研究　出處：《浙江大學》2017年博士論文　論文類型：學位論文

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【摘要】：人血白蛋白(HSA)是人體血漿中最重要的蛋白質之一,廣泛應用于多個領域,市場需求巨大。人血漿來源HSA(pHSA)受限于血漿,以及病毒污染等風險,導致貨源緊張。基因重組人血白蛋白(rHSA)能避免病毒感染,解決原料緊張等問題,不過分離純化要求高。常規(guī)rHSA分離中常用陽離子交換層析捕獲rHSA,料液需要稀釋和pH調節(jié),影響分離效率,研發(fā)具有高選擇性和耐鹽特性的新型分離方法將有助于改善rHSA分離工藝�；旌夏Ｊ綄游�(MMC)和擴張床吸附(EBA)是兩種新型的生物分離方法,MMC具有吸附量大、選擇性高、耐鹽性好、洗脫條件溫和等優(yōu)點,EBA可直接從含有生物質固體顆粒的料液中捕獲目的蛋白。本文從新型配基篩選和介質制備出發(fā),探討MMC和EBA分離rHSA新過程,發(fā)揮MMC高效分離和EBA高處理量的優(yōu)勢,形成混合模式擴張床吸附新方法,實現(xiàn)酵母發(fā)酵液中分離rHSA。主要研究內容包括:(1)基于色氨酸類似物的混合模式配基篩選。依據(jù)HSA可結合色氨酸的特點,篩選色氨酸及其類似物作為配基,制備了 10種混合模式介質,比較了 HSA吸附性能。發(fā)現(xiàn)HSA吸附受pH影響顯著,最高吸附容量出現(xiàn)在HSA等電點附近,以色胺為配基的TA-B介質飽和吸附容量最高,達143.54 mg/ml。酸性條件下,飽和吸附容量和結合常數(shù)下降明顯。添加鹽后,HSA吸附容量下降,不過TA-B介質在高鹽下仍有較高的吸附容量(約95mg/ml)。結果表明,以色胺為配基的TA-B介質對HSA具有較強的親和力,良好的耐鹽特性,且在較寬的pH范圍內具有較高的吸附容量。(2)以色胺為配基的混合模式介質制備及吸附性能。以色胺為功能配基,3種瓊脂糖微球為基質,優(yōu)化基質活化和配基偶聯(lián)過程,制備了系列配基密度的色胺介質。pHSA靜態(tài)吸附結果顯示,配基密度影響蛋白吸附,合適的基質和中等配基密度可以得到較理想的吸附容量。相比于商業(yè)化混合模式介質,TA-B-6FF對HSA的吸附容量更高。吸附動力學實驗顯示,pH 5.0時吸附速率最快,有效孔擴散系數(shù)最高,添加鹽會減緩蛋白在介質內的擴散速率。蛋白穿透實驗表明,TA-B-6FF介質的動態(tài)結合能力較強,流速對動態(tài)載量影響較小,在700cm/h高流速仍具有較高的動態(tài)載量(54.5 mg/ml),適合用于高流速操作。(3)混合模式層析分離重組人血白蛋白。以畢赤酵母發(fā)酵液為原料,考察了TA-B-6FF層析分離rHSA。rHSA靜態(tài)吸附規(guī)律與pHSA類似,pH 5.0時吸附最佳,Qm為54.60 mg/ml;在pH 6.0～8.0范圍內,變化較小;pH 4.0時,吸附容量顯著下降。料液稀釋對rHSA吸附影響不大,發(fā)酵液可不經(jīng)過稀釋和pH調節(jié)直接上樣。動態(tài)載量隨流速增加而逐漸降低,流速為100～300cm/h時,Q10%為19.7～30.3 mg/ml介質,上樣量約2.0～3.5 ml發(fā)酵液/ml介質。優(yōu)化分離工藝,采用兩步洗脫,rHSA單體收率為98.5%,純度為87.8%,純化因子約11,色素和HCP去除率約90%。經(jīng)20次層析分離驗證,過程穩(wěn)定性良好。(4)混合模式擴張床吸附分離重組人血白蛋白。以石英砂/瓊脂糖和碳化鎢/瓊脂糖復合多孔微球為基質,色胺為配基,制備了混合模式擴張床介質TA-S和TA-T。靜態(tài)吸附結果表明,pH5.0時HSA吸附最佳,TA-S和TA-T飽和吸附容量分別為164.18 mg/ml和72.06 mg/ml,且具有一定的耐鹽吸附特性。固定床模式下,流速對蛋白吸附的影響較大;擴張床模式下,膨脹率越大,蛋白穿透越快,動態(tài)載量逐漸下降,最佳膨脹率為1.8,TA-S和TA-T的動態(tài)載量分別為27.54 mg/ml和18.04mg/ml介質。酵母發(fā)酵液調節(jié)pH5.0后直接上樣,采用兩步洗脫,TA-S介質擴張床吸附分離效果較好,rHSA單體收率和純度分別為91.6%和83.3%。(5)HSA與色胺介質的相互作用分析。采用分子模擬,通過分子對接確定HSA表面有4個潛在的色胺結合位點,其中一個位于典型的吲哚結合位點。分子動力學模擬結果顯示,色胺配基與HSA結合穩(wěn)定,結合位點周圍以疏水氨基酸殘基為主,但部分負電或極性殘基貢獻更大的靜電作用能,說明色胺-HSA結合以靜電作用為主,氫鍵和疏水作用為輔。等溫滴定量熱分析表明,pH4.0～7.0時,色胺介質主要通過靜電作用吸附HSA,pH 8.0時HSA結合以疏水作用為主;隨NaCl濃度增大,色胺-HSA相互作用由靜電為主轉變?yōu)槭杷饔脼橹�。本文圍繞rHSA分離,集中于MMC和EBA兩種新型生物分離方法,從配基篩選、介質制備和吸附性能出發(fā),通過分離過程優(yōu)化實現(xiàn)酵母發(fā)酵液中高效分離rHSA,形成混合模式層析和擴張床吸附新方法,提高分離效率和過程處理能力,顯示出良好的應用潛力。
[Abstract]:Human plasma albumin ( HSA ) is one of the most important proteins in human plasma , which is widely used in many fields . It has the advantages of high adsorption capacity , high selectivity , good salt tolerance and mild elution conditions . The results showed that the dynamic binding capacity of TA - B - 6FF medium was higher than that of the commercial mixed mode medium . The adsorption capacity of the medium was higher than that of the medium . The adsorption capacity of the medium was about 2.0 锝，

本文編號：1377627