本文關(guān)鍵詞：麥芽三糖酶催化作用機(jī)制及其應(yīng)用研究　出處：《江南大學(xué)》2017年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

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【摘要】：麥芽三糖酶(α-maltotriohydrolase,EC 3.2.1.116),是糖苷水解酶家族GH13中的一員,也歸屬于麥芽低聚糖酶。麥芽低聚糖酶一般定義為外切型α-淀粉酶,廣泛應(yīng)用于淀粉改性和烘焙食品的淀粉回生控制等。目前普遍認(rèn)為麥芽三糖酶的作用機(jī)制為通過內(nèi)切方式作用于淀粉生成麥芽三糖,然而其具體作用機(jī)制并未明確。麥芽三糖酶等麥芽低聚糖酶的作用機(jī)制的不明晰,嚴(yán)重制約了其在食品工業(yè)中的應(yīng)用。本課題由來源于Microbacterium imperiale的麥芽三糖的純化制備入手,探析該酶的催化水解作用機(jī)制,及其在淀粉回生和消化性調(diào)控方面的應(yīng)用,并利用新發(fā)現(xiàn)的該酶的轉(zhuǎn)糖基活性對(duì)甜菊糖苷進(jìn)行酶法改性,為其在食品工業(yè)的應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。首先,采用透析、HiTrap Desalting脫鹽柱凝膠色譜、HiTrap~(TM) Q fast flow離子交換色譜和超濾離心濃縮等酶分離純化技術(shù),從商業(yè)酶AMT 1.2L中制備得到麥芽三糖酶。利用SDS-PAGE凝膠電泳對(duì)所得麥芽三糖酶進(jìn)行鑒定,所得酶達(dá)到電泳純,相對(duì)分子質(zhì)量約為5.39×10~4;比酶活力為64.8 U/mg,純化倍數(shù)達(dá)到22.5。該酶的基本酶學(xué)性質(zhì):最適溫度為50℃,最適pH為6.5;麥芽三糖酶為Ca~(2+)依賴型淀粉酶,5 mM Ca~(2+)能夠有效提高其熱穩(wěn)定性。借助TLC和HPLC分析技術(shù)對(duì)不同底物的酶解產(chǎn)物進(jìn)行分析,發(fā)現(xiàn)麥芽三糖酶可水解環(huán)糊精類底物,驗(yàn)證了其內(nèi)切活性;底物淀粉的結(jié)構(gòu)(直鏈淀粉或者支鏈淀粉)決定了酶解速率和產(chǎn)物中麥芽三糖的純度。接著,以直鏈淀粉為底物,比較了不同淀粉酶的多重水解能力:Aspergillus oryzaeα-淀粉酶豬胰α-淀粉酶≈麥芽三糖酶β-淀粉酶。借助HPSEC和TLC分別對(duì)直鏈淀粉和麥芽低聚糖衍生物(pNPG5和pNPG6)酶解產(chǎn)物進(jìn)行分析,證明了麥芽三糖酶通過內(nèi)外切共同作用的方式水解直鏈淀粉:首先通過內(nèi)切方式降低直鏈淀粉的Mw,進(jìn)而通過外切方式生成麥芽三糖。進(jìn)一步借助TLC和HPAEC對(duì)麥芽低聚糖的水解產(chǎn)物進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)麥芽三糖酶在水解麥芽低聚糖(DP_n,n=4-7)時(shí)還表現(xiàn)出轉(zhuǎn)糖基活性,生成DPn±3低聚糖。與此同時(shí),借助TLC證明了葡萄糖、麥芽糖、麥芽三糖和pNPG1均可作為麥芽三糖酶轉(zhuǎn)三糖基反應(yīng)的糖基受體。其次,以支鏈淀粉為底物,借助HPSEC-MALLS-RI和HPAEC研究了麥芽三糖酶的酶解規(guī)律,發(fā)現(xiàn)酶先通過外切方式作用于支鏈淀粉的外鏈,生成麥芽三糖;隨后通過內(nèi)切方式作用于支鏈淀粉的內(nèi)鏈,顯著降低其Mw,并生成新的非還原性末端。利用大麥β-淀粉酶的外切活性作用于支鏈淀粉,制備得到不同外鏈長(zhǎng)的β-糊精。以支鏈淀粉和β-糊精為底物,測(cè)定酶的酶動(dòng)力學(xué)參數(shù),發(fā)現(xiàn)隨著平均鏈長(zhǎng)和外鏈長(zhǎng)的降低,底物的米氏常數(shù)(K_m)不斷增大,催化效率(k_(cat)/K_m)卻顯著降低;其中β-糊精3(即β-極限糊精)的K_m為支鏈淀粉的8倍,k_(cat)/K_m卻僅為支鏈淀粉的6.5%,這表明支鏈淀粉的外鏈比內(nèi)鏈更易于被麥芽三糖酶作用,且長(zhǎng)外鏈比短外鏈更易與酶發(fā)生反應(yīng)。利用DSC研究了淀粉的回生性質(zhì),發(fā)現(xiàn)麥芽三糖酶作用能夠抑制支鏈淀粉的回生:當(dāng)支鏈淀粉水解率15.9%時(shí),在4℃儲(chǔ)藏7 d后并未出現(xiàn)回生焓,表明其回生被完全抑制。結(jié)合支鏈淀粉的酶解機(jī)制,推測(cè)麥芽三糖酶能夠抑制支鏈淀粉回生的機(jī)制是因?yàn)橹ф湹矸鄣耐怄湵凰馍蒁P9的極短鏈和麥芽低聚糖(麥芽三糖為主)。再次,通過控制麥芽三糖酶的水解時(shí)間調(diào)控其對(duì)普通玉米淀粉的分子結(jié)構(gòu)的改性程度,改善其消化性質(zhì)。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)麥芽三糖酶改性淀粉促進(jìn)慢消化淀粉(SDS)的形成,其中酶解30 min制備得到的SDS含量最高,達(dá)到19.4%,為未經(jīng)酶處理淀粉1.5倍。借助HPSEC-MALLS-RI,HPAEC和~1H NMR對(duì)酶改性淀粉的分子精細(xì)結(jié)構(gòu)進(jìn)行解析,得出SDS的增加主要是因?yàn)?麥芽三糖酶以外切作用于玉米淀粉中支鏈淀粉的外鏈,促使DP13短鏈的大量生成和α-1,6糖苷鍵比率的增加,提高了淀粉的抗酶解性。然后,采用麥芽三糖酶和普魯蘭酶復(fù)合處理制備抗性淀粉(RS3),研究結(jié)果表明:反應(yīng)溫度50℃、pH 6.5、麥芽三糖酶添加量12 U/g、反應(yīng)時(shí)間2 h,此時(shí)玉米淀粉水解率為13.9%,隨后用普魯蘭酶脫支處理,回生48 h后制備得到的樣品中RS3含量為40.8%。借助HPSEC和XRD等分析了回生淀粉的鏈長(zhǎng)分布和晶體結(jié)構(gòu),并采用Pearson相關(guān)系數(shù)對(duì)所得結(jié)果進(jìn)行相關(guān)性分析,發(fā)現(xiàn)經(jīng)麥芽三糖酶處理后玉米淀粉脫支淀粉中DP 30-130部分所占比率增加,導(dǎo)致回生淀粉晶型從B型向B+V型轉(zhuǎn)變,同時(shí)提高了淀粉相對(duì)結(jié)晶度和抗酶解性能,從而促進(jìn)了RS3的形成。為了分析麥芽三糖酶促進(jìn)抗性淀粉形成的機(jī)制,進(jìn)一步采用HPSEC-MALLS-RI對(duì)麥芽三糖酶不同酶添加量酶解得到的玉米淀粉的分子結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析,結(jié)果表明麥芽三糖酶通過先外切后作用于支鏈淀粉,以及內(nèi)切方式作用于直鏈淀粉和支鏈淀粉的內(nèi)鏈,有效提高了脫支普通玉米淀粉中DP 30-130所占比率,進(jìn)而提高RS3的生成量。最后,通過HPLC和UHPLC-MS/MS等分析技術(shù)驗(yàn)證麥芽三糖酶的轉(zhuǎn)糖基活性,結(jié)果表明:麥芽三糖酶能夠選擇性的對(duì)甜菊糖苷進(jìn)行轉(zhuǎn)糖基作用,生成產(chǎn)物以麥芽三糖基-甜菊糖苷為主�？疾旆磻�(yīng)條件對(duì)于轉(zhuǎn)糖基反應(yīng)過程中甜菊糖苷轉(zhuǎn)化率的影響,結(jié)果表明,在甜菊糖苷15 mg/mL,可溶性淀粉150 mg/m L,pH 6.5,反應(yīng)溫度55℃,酶添加量為40 U/mL,反應(yīng)時(shí)間為3 h的實(shí)驗(yàn)條件下,此時(shí)甜菊糖苷的轉(zhuǎn)化率最高可達(dá)46%。采用大孔樹脂D101對(duì)酶法改性甜菊糖苷進(jìn)行精制,并借助感官評(píng)價(jià)和儲(chǔ)藏穩(wěn)定性試驗(yàn)對(duì)其進(jìn)行評(píng)價(jià),發(fā)現(xiàn)酶改性甜菊糖苷的甜度為改性前甜菊糖苷1.2倍;儲(chǔ)藏28 d,甜菊糖苷、萊鮑迪甙A和麥芽三糖酶改性甜菊糖苷水溶液(1%,w/v)的保留率分別為49.8%,26.2%和70.6%。由此可見,麥芽三糖酶酶法改性能夠顯著增加甜菊糖苷的甜度,削弱苦澀的后味并提高其水溶液的儲(chǔ)藏穩(wěn)定性。
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【學(xué)位授予單位】：江南大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：TS201.25

【參考文獻(xiàn)】

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