本文關(guān)鍵詞：石墨烯基納米復(fù)合材料的合成與抗菌性能研究　出處：《中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院》2017年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

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【摘要】：雖然當(dāng)今已步入醫(yī)療技術(shù)高度發(fā)達(dá)、健康促進(jìn)行業(yè)多元發(fā)展的時(shí)代,但是病原菌感染仍然是人類面臨的重要健康威脅之一,每年導(dǎo)致數(shù)以百萬(wàn)計(jì)的感染患者出現(xiàn)。近年來(lái),抗生素的不合理應(yīng)用已引起嚴(yán)重的細(xì)菌耐藥問(wèn)題,日益增多的耐藥菌致使抗生素療效不斷下降,尤其是“超級(jí)細(xì)菌”的出現(xiàn)更使臨床治療幾乎陷入了無(wú)藥可用的境地。此外,由于新藥研發(fā)滯后同時(shí)缺乏理想的抗生素替代療法,細(xì)菌耐藥迫使抗生素用量持續(xù)攀升,然而抗生素的過(guò)量使用反過(guò)來(lái)又加速了細(xì)菌新的耐藥機(jī)制的產(chǎn)生,同時(shí)也導(dǎo)致了嚴(yán)重的藥物不良反應(yīng)以及大范圍的環(huán)境污染,這似乎陷入了一個(gè)惡性循環(huán)。當(dāng)前細(xì)菌耐藥已成為世界范圍內(nèi)迫需解決的公共衛(wèi)生難題。鑒于細(xì)菌耐藥對(duì)人類健康造成的嚴(yán)重威脅,而傳統(tǒng)抗生素難以有效應(yīng)對(duì)的困境,人類不得不重新審視未來(lái)抗感染治療的發(fā)展方向,探索抗生素外新型、廉價(jià)、有效的抗菌物質(zhì)或治療方法顯得尤為重要。近年來(lái)非抗生素類抗菌物質(zhì)的研究也因此成為科學(xué)熱點(diǎn),其中納米抗菌材料的研發(fā)則被認(rèn)為是最有希望克服細(xì)菌耐藥問(wèn)題并有實(shí)際應(yīng)用前景的策略。這主要得益于納米抗菌材料獨(dú)特的物理化學(xué)特性及其固有或通過(guò)功能化修飾獲得的高效殺菌活性,而這些納米特性正是常態(tài)結(jié)構(gòu)物質(zhì)所不具備的,為此很多學(xué)者甚至提出了“納米抗生素”的概念。作為新興納米材料,氧化石墨烯(graphene oxide,GO)由于超高的表面體積比、優(yōu)異的平面性、豐富的可修飾功能集團(tuán)以及良好的生物相容性,成為了抗菌活性物質(zhì)的理想載體。具備良好抗菌活性的銀納米粒子(AgNPs)是最早被負(fù)載到GO上的納米材料之一,所合成的氧化石墨烯-銀(GO-Ag)納米抗菌復(fù)合材料由于組分間協(xié)同效應(yīng)的產(chǎn)生,展現(xiàn)了優(yōu)異的殺菌性能。近年來(lái),眾多類型的GO-Ag納米抗菌復(fù)合材料也因此得到了廣泛的研究與報(bào)道。綜述文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn),當(dāng)前報(bào)道的各類GO-Ag在水中具備良好的穩(wěn)定性,但鮮有研究關(guān)注其在生理溶液中的穩(wěn)定性及其長(zhǎng)效殺菌性能,而這些性能對(duì)其實(shí)際應(yīng)用非常重要;此外,目前關(guān)于GO是否具有固有抗菌活性也還存在很大爭(zhēng)議。因此,為解決/闡明以上科學(xué)問(wèn)題,本文在研究GO自身抗菌活性的基礎(chǔ)上,分別利用具有良好溶解性的大分子聚合物聚乙二醇(PEG)和聚乙烯亞胺(PEI)對(duì)GO進(jìn)行功能化修飾,并進(jìn)一步負(fù)載AgNPs,合成了兩種石墨烯基納米抗菌復(fù)合材料,并對(duì)它們進(jìn)行了系統(tǒng)表征與功能評(píng)價(jià)。第一部分針對(duì)當(dāng)前GO在固有抗菌活性上存在的爭(zhēng)議,實(shí)驗(yàn)室自制了GO并進(jìn)行了深度純化及系統(tǒng)表征,通過(guò)殺菌評(píng)價(jià)及形態(tài)學(xué)表征對(duì)GO的固有殺菌活性進(jìn)行驗(yàn)證。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明GO未展現(xiàn)出明顯殺菌活性,TEM下經(jīng)GO處理后的細(xì)菌形態(tài)與對(duì)照組相比未觀察到明顯變化;此外,與菌體作用后,GO出現(xiàn)了明顯的聚集和相互堆疊,致使其片層增厚及邊緣鈍化,進(jìn)而導(dǎo)致GO失去了物理切割作用,這可能是GO在生理溶液中不能發(fā)揮殺菌作用的重要原因。第二部分通過(guò)對(duì)GO進(jìn)行PEG功能化修飾及AgNPs負(fù)載,制備了GO-PEG-Ag納米復(fù)合材料。結(jié)合構(gòu)效關(guān)系,對(duì)比分析了不同實(shí)驗(yàn)因素對(duì)納米材料制備的影響,確定了先共價(jià)修飾PEG后進(jìn)行AgNPs負(fù)載的功能化修飾順序,篩選了AgNPs的合成前體并優(yōu)化了反應(yīng)條件,制定了簡(jiǎn)便易行的石墨烯基納米抗菌復(fù)合材料合成方案。通過(guò)AFM、UV-vis吸收光譜、XRD、FTIR、TGA、Zeta電位及粒度分析、TEM/HRTEM及AAS等手段對(duì)納米復(fù)合材料的形貌、結(jié)構(gòu)、功能集團(tuán)及組分含量等性質(zhì)進(jìn)行了系統(tǒng)表征與分析。結(jié)果證實(shí)本研究借助微波輔助,不需額外添加還原劑,在3 min內(nèi)即可完成AgNPs在復(fù)合材料上的原位還原及負(fù)載,形成的AgNPs以高密度(~27 wt%)均勻地覆蓋在整個(gè)納米復(fù)合物表面,并具有粒徑小(~7nm)、尺寸均一、晶體結(jié)構(gòu)良好等優(yōu)點(diǎn)。穩(wěn)定性測(cè)試表明GO-PEG-Ag納米復(fù)合材料在多種生理溶液中分別經(jīng)靜置1個(gè)月甚至10000 g離心5min處理后仍可維持良好的分散狀態(tài)。通過(guò)時(shí)間動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn)考查了殺菌效果與作用時(shí)間的變化關(guān)系,確定了GO-PEG-Ag達(dá)到穩(wěn)定殺菌效果所需的適宜作用時(shí)間(2.5 h)。以GO-Ag納米材料為對(duì)照,通過(guò)最低抑菌濃度(MIC)測(cè)試、即時(shí)/長(zhǎng)效殺菌實(shí)驗(yàn)、細(xì)胞毒性分析等實(shí)驗(yàn),系統(tǒng)考查并對(duì)比分析了GO-PEG-Ag納米材料的殺菌能力及細(xì)胞毒性。結(jié)果表明GO-PEG-Ag對(duì)標(biāo)準(zhǔn)菌株及耐藥菌株展現(xiàn)了同等高效的殺菌效果,5μg/ml材料濃度對(duì)包括耐藥菌(含blaNDM-1和mcr-1)及標(biāo)準(zhǔn)菌在內(nèi)的革蘭氏陰性菌E.coli的殺菌率99.5%,10μg/ml材料濃度對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌標(biāo)準(zhǔn)S.aureus及耐甲氧西林的S.aureus(MRSA)的殺菌率95%。濃度高達(dá)50μg/ml的GO-PEG-Ag對(duì)HeLa細(xì)胞刺激24 h后,細(xì)胞存活率仍可保持在80%左右。同步對(duì)比結(jié)果證實(shí),三元GO-PEG-Ag復(fù)合材料在殺菌能力及生物相容性上均要優(yōu)于二元GO-Ag納米復(fù)合材料,尤其是在長(zhǎng)效殺菌性能上,GO-PEG-Ag兼?zhèn)淞烁咝耘c穩(wěn)定性,生理鹽水中靜置1周的時(shí)間內(nèi),其殺菌率未觀察到明顯下降,波動(dòng)范圍5%;相反,GO-Ag長(zhǎng)效殺菌能力較差,同等條件下其殺菌率下降超過(guò)65%。闡明了納米材料生理?xiàng)l件下穩(wěn)定性與殺菌效能之間的正向促進(jìn)關(guān)系。我們又通過(guò)TEM、熒光共聚焦顯微鏡及蛋白質(zhì)泄露、活性氧(ROS)及ATP水平檢測(cè)等手段進(jìn)一步探究了GO-PEG-Ag納米材料的殺菌機(jī)制。結(jié)果表明破壞細(xì)胞壁/膜結(jié)構(gòu)、導(dǎo)致細(xì)胞質(zhì)滲漏、誘導(dǎo)氧化應(yīng)激損傷及影響細(xì)菌代謝功能可能是納米復(fù)合材料主要的殺菌機(jī)制。第三部分通過(guò)引入陽(yáng)離子聚合物支鏈PEI成功制備了GO-PEI-Ag納米抗菌復(fù)合材料,并其進(jìn)行了系統(tǒng)表征與功能評(píng)價(jià)。結(jié)果表明,GO-PEI-Ag納米復(fù)合材料在性能上與GO-PEG-Ag相近,同樣具備多種生理溶液中優(yōu)異的穩(wěn)定分散能力。此外由于帶有更高的正電性,促使GO-PEI-Ag更容易捕獲溶液中帶負(fù)電性的細(xì)菌,致使其殺菌能力更優(yōu)于GO-PEG-Ag。當(dāng)作用濃度為10μg/ml時(shí),GO-PEI-Ag對(duì)包括多種耐藥菌在內(nèi)的E.coli及A.baumannii的即時(shí)殺菌率均達(dá)到了~100%,對(duì)S.aureus標(biāo)準(zhǔn)菌株和MRSA的即時(shí)殺菌率也分別達(dá)到了99.1%和98.0%。長(zhǎng)效殺菌能力測(cè)試結(jié)果顯示,GO-PEI-Ag在生理鹽水中存儲(chǔ)1周后對(duì)E.coli及A.baumannii的殺菌率99%,對(duì)S.aureus標(biāo)準(zhǔn)菌株和MRSA的殺菌率96%。細(xì)胞毒性測(cè)試顯示經(jīng)50μg/ml的GO-PEI-Ag刺激24 h后,HeLa細(xì)胞存活率為~72%,表明GO-PEI-Ag同樣具有較低的生物毒性。綜上所述,本研究成功制備了兩種可穩(wěn)定分散于生理介質(zhì)中的石墨烯基納米抗菌復(fù)合材料。GO-PEG-Ag和GO-PEI-Ag具備高效殺菌性、良好生物相容性及長(zhǎng)效性的優(yōu)點(diǎn),表明它們?cè)谏镝t(yī)藥和公共衛(wèi)生領(lǐng)域具有良好的應(yīng)用前景,并有希望成為抗生素外應(yīng)對(duì)病原菌,尤其是耐藥菌感染的替代治療手段。同時(shí)也希望通過(guò)本文為相關(guān)納米抗菌材料的研究制備提供理論與實(shí)踐參考。
【學(xué)位授予單位】：中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：TB332

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