本文關(guān)鍵詞：馬奶酒中產(chǎn)胞外多糖瑞士乳桿菌的篩選及多糖的結(jié)構(gòu)和抗氧化活性研究　出處：《沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)》2017年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

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【摘要】：近年來乳酸菌胞外多糖因具有獨(dú)特的流變特性和良好的功能特性備受關(guān)注,廣泛應(yīng)用于食品工業(yè)和醫(yī)藥工業(yè)。馬奶酒是我國(guó)少數(shù)民族地區(qū)的傳統(tǒng)乳制品,含有豐富的乳酸菌,具有獨(dú)特風(fēng)味和營(yíng)養(yǎng)保健功能。來源于馬奶酒的乳酸菌除具有自身的生物活性外,其代謝產(chǎn)生的胞外多糖(EPS)也具備多種生理功能。本研究從內(nèi)蒙古東部區(qū)的馬奶酒中分離乳酸菌,全面分析并歸屬了可以產(chǎn)生EPS的乳酸菌,并篩選了高產(chǎn)EPS的瑞士乳桿菌;為了提高EPS的產(chǎn)量,采用誘變的方法獲得目標(biāo)菌株并優(yōu)化了培養(yǎng)條件;探究了 EPS生物合成途徑中關(guān)鍵酶類對(duì)EPS產(chǎn)量和結(jié)構(gòu)的影響;通過多種結(jié)構(gòu)表征方法,測(cè)定了 EPS的分子量、單糖組成和多糖一級(jí)結(jié)構(gòu);通過體外和體內(nèi)試驗(yàn)研究了馬奶酒中瑞士乳桿菌EPS的部分生理功能,為更好的挖掘馬奶酒的營(yíng)養(yǎng)保健功能奠定基礎(chǔ)。主要研究結(jié)果如下:(1)以來源于內(nèi)蒙古東部區(qū)不同牧民家庭的12份馬奶酒為樣品進(jìn)行乳酸菌多樣性分析,獲得72株乳酸菌,其中56株具有合成EPS的能力。經(jīng)過傳統(tǒng)鑒定和16S rRNA序列同源性分析,將產(chǎn)EPS的乳酸菌被歸屬為堅(jiān)強(qiáng)腸球菌、乳酸乳球菌、瑞士乳桿菌、干酪乳桿菌、植物乳桿菌、德氏乳桿菌和腸膜明串珠菌腸膜亞種七類,其中瑞士乳桿菌胞外多糖產(chǎn)量最高,平均產(chǎn)量可達(dá)到110.39 mg/L。(2)以分離的16株瑞士乳桿菌為試驗(yàn)對(duì)象,篩選出EPS產(chǎn)量最高的L.helveticus SMN2-1為試驗(yàn)菌株進(jìn)行誘變篩選。分別采用紫外線、亞硝基胍進(jìn)行單一誘變確定初始誘變條件,再利用Box-Behnken設(shè)計(jì),以紫外線照射時(shí)間、亞硝基胍的濃度以及處理時(shí)間3個(gè)因素為變量,進(jìn)行紫外線-亞硝基胍復(fù)合誘變,確定的最佳誘變條件為紫外線照射時(shí)間40.37 s、亞硝基胍濃度0.35 mg/mL、處理時(shí)間34.87 min,致死率88.65%。通過初篩和復(fù)篩,獲得了傳代穩(wěn)定性好,EPS產(chǎn)量最高菌株,命名為L(zhǎng).helveticus UN-8。(3)分別對(duì)影響誘變菌株L.helveticus UN-8胞外多糖生物合成條件的碳源、氮源、發(fā)酵時(shí)間、發(fā)酵溫度、初始pH、接種量等因素進(jìn)行單因素試驗(yàn),確定了L.helveticus UN-8生物合成EPS的最佳條件范圍。應(yīng)用Plackett-Burman和Box-Behnken設(shè)計(jì)確定了影響L.helveticus UN-8合成胞外多糖的產(chǎn)量主要因素和最適條件為乳糖加入量21.65 g/L,發(fā)酵時(shí)間28.79 h,接種量2.01%,最終EPS合成量達(dá)到408.5 mg/L,比初始菌株L.helveticvs SMN2-1產(chǎn)量提高了 2.1倍。(4)初始菌株L.helveticusSMN2-1和誘變菌株L.helveticus UN-8的粗多糖經(jīng)DEAE-52離子交換層析、凝膠滲透柱層析進(jìn)一步純化,獲得純品多糖,分子量分別為EPS-S1為 1.01×106Da;EPS-S2 為 1.5×106Da;EPS-U1 為 0.85×106Da;EPS-U2 為 1.2×106Da。四種多糖的單糖組成均由不同比例的葡萄糖和半乳糖組成。通過紅外光譜分析、甲基化的GC-MS和一維、二維核磁共振分析,推斷出兩種多糖(EPS-S1和EPS-U1)的一級(jí)結(jié)構(gòu)。(5)分析了初始菌株L.helveticus SMN2-1和誘變菌株L.helveticus UN-8分別以乳糖和葡萄糖為底物時(shí)生物合成胞外多糖過程中酶的活性與EPS產(chǎn)量之間的關(guān)系。結(jié)果表明:當(dāng)以不同糖類為碳源時(shí),雖然EPS產(chǎn)量、分子量、單糖比例差異明顯,但是單糖組成無變化;α-PGM是獲得高產(chǎn)EPS的關(guān)鍵酶,α-PGM酶活性的升高直接提高EPS的產(chǎn)量,GalT活性也影響EPS產(chǎn)量。(6)EPS-S1、EPS-U1在體外均具有較強(qiáng)的清除DPPH、超氧陰離子、羥基自由基及其抗脂質(zhì)過氧化能力。小鼠體內(nèi)試驗(yàn)結(jié)果表明EPS-S1可以顯著提高衰老模型小鼠的血清、腦組織和肝臟中多種抗氧化酶(包括SOD、GPx和CAT)的活力和總抗氧化能力,降低了 MDA的水平,證實(shí)了 EPS-S1在體內(nèi)具有一定的抗氧化活性。此外,EPS-S1可激活NK和CTL細(xì)胞活性和顯著提高血清中細(xì)胞免疫因子IL-2、IL-10和TNF-α的水平,從而提高機(jī)體的免疫力。
【學(xué)位授予單位】：沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：TS201.3

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本文編號(hào)：1312187