本文關(guān)鍵詞：復(fù)雜環(huán)境下蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)、功能與穩(wěn)定性的NMR研究

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【摘要】：細(xì)胞環(huán)境極其復(fù)雜,大分子擁擠、空間上的限域以及弱相互作用普遍存在。蛋白質(zhì)發(fā)揮功能的天然細(xì)胞環(huán)境很可能會(huì)影響到蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)、功能以及穩(wěn)定性。核磁共振能夠在原子分辨率上提供蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)、功能以及穩(wěn)定性信息。NMR能夠在溶液狀態(tài)下研究擁擠、限域等環(huán)境效應(yīng)對(duì)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的影響。我們運(yùn)用NMR研究反膠束模擬的限域環(huán)境對(duì)多結(jié)構(gòu)域蛋白結(jié)構(gòu)與功能的影響;并利用19F NMR方法研究擁擠以及限域環(huán)境對(duì)KH1蛋白穩(wěn)定性的影響。反膠束限域環(huán)境影響了多結(jié)構(gòu)域蛋白的結(jié)構(gòu)。蛋白質(zhì)限域不僅是細(xì)胞內(nèi)包括伴侶蛋白腔內(nèi)蛋白質(zhì)的折疊與錯(cuò)誤折疊、核糖體內(nèi)蛋白質(zhì)的生物合成、易位子內(nèi)蛋白質(zhì)的運(yùn)輸?shù)壬镞^程的關(guān)鍵因素;同樣在藥物運(yùn)輸、酶萃取與恢復(fù)以及治療藥物的保護(hù)等工業(yè)應(yīng)用中也扮演著重要的角色。限域環(huán)境對(duì)多結(jié)構(gòu)域蛋白結(jié)構(gòu)的影響目前尚不清楚。我們利用NMR方法研究了反膠束限域環(huán)境對(duì)多結(jié)構(gòu)域蛋白鈣調(diào)蛋白以及其復(fù)合物結(jié)構(gòu)的影響。結(jié)果表明限域不會(huì)影響多結(jié)構(gòu)域蛋白復(fù)合物holoCaM-MLCK的結(jié)構(gòu);該復(fù)合物在稀溶液中形成緊湊剛性結(jié)構(gòu)。多結(jié)構(gòu)域蛋白holoCaM在稀溶液中形成伸展的結(jié)構(gòu),限域會(huì)促使holoCaM形成緊湊的結(jié)構(gòu),結(jié)構(gòu)域之間存在著接觸。除了結(jié)構(gòu)域第四個(gè)螺旋的取向有一些差異外,N端與C端結(jié)構(gòu)域的整體結(jié)構(gòu)與稀溶液中伸展構(gòu)象的結(jié)構(gòu)域結(jié)構(gòu)類似。反膠束限域環(huán)境改變了 holoCaM功能。我們通過holoCaM的1H-15N HSQC滴定實(shí)驗(yàn)研究限域所引起的結(jié)構(gòu)上變化對(duì)功能的影響。結(jié)果表明限域環(huán)境改變了 holoCaM的功能:holoCaM在稀溶液中可以和MLCK、AcN19以及somatostatin結(jié)合;在反膠束中只能與MLCK和AcN19結(jié)合。雖然親和力顯著不同,但holoCaM在稀溶液中和MLCK以及AcN19結(jié)合后各自形成緊湊的結(jié)構(gòu)。CaM-somatostatin復(fù)合物的PCS和RDC數(shù)據(jù)表明該復(fù)合物結(jié)主要以伸展的構(gòu)象存在。結(jié)構(gòu)上的差異暗示holoCaM在反膠束中結(jié)合MLCK和AcN19,而不結(jié)合somatostatin很有可能是體積選擇的結(jié)果而不是由結(jié)合力強(qiáng)弱來決定。與holoCaM的緊湊結(jié)構(gòu)相比,CaM-somatostatin復(fù)合物的伸展構(gòu)象占據(jù)更大的空間。由于反膠束內(nèi)的有限空間,holoCaM傾向于自己形成緊湊結(jié)構(gòu),而不是和somatostatin相互作用。復(fù)雜環(huán)境下KH1蛋白折疊以及結(jié)合的熱力學(xué)。細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)的折疊與結(jié)合通常發(fā)生在擁擠以及限域的環(huán)境內(nèi)。已有的研究表明擁擠和限域環(huán)境會(huì)改變蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性,但是對(duì)同一個(gè)蛋白在不同復(fù)雜環(huán)境下的穩(wěn)定性的全面性分析研究很少。我們運(yùn)用19F NMR研究了擁擠環(huán)境和限域環(huán)境對(duì)蛋白質(zhì)穩(wěn)定性的影響。結(jié)果表明KH1在擁擠試劑中穩(wěn)定性增加,熵值減小而焓值減小。擁擠試劑的單體(sucrose、EG、glucose)比其多聚物(ficoll 70、PEG 200、dextran 70)更能穩(wěn)定蛋白質(zhì),蛋白質(zhì)在擁擠試劑單體中比在多聚體中熵值更大而焓值更小,這與大分子擁擠的理論相違背。KH1在反膠束中穩(wěn)定性降低,是焓值增加而熵值也增加的。我們的結(jié)果與硬核排阻體積理論預(yù)測的結(jié)果完全相違背。蛋白質(zhì)和反膠束內(nèi)表面的化學(xué)相互作用可能起作用,這種化學(xué)相互作用的幾何性很有可能發(fā)揮作用。綜上所述,我們利用NMR研究了復(fù)雜環(huán)境對(duì)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)、功能以及穩(wěn)定性的影響。我們認(rèn)為細(xì)胞很有可能利用環(huán)境效應(yīng)來調(diào)控蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)、功能與穩(wěn)定性。
【學(xué)位授予單位】：中國科學(xué)院大學(xué)(中國科學(xué)院武漢物理與數(shù)學(xué)研究所)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：O629.7

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本文編號(hào)：1288950