本文關(guān)鍵詞：基于生物傳感器的革蘭氏陰性菌非靶向篩查技術(shù)研究

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【摘要】：目前,食品安全已成為全球性問(wèn)題,惡性食品污染事件頻繁爆發(fā)。隨著食品加工技術(shù)的日新月異,帶來(lái)的食品安全隱患不容忽視。由此造成的食源性疾病更成為影響公眾健康的重要因素。據(jù)報(bào)道,約有三分之二的食源性疾病是由細(xì)菌引起的。傳統(tǒng)的細(xì)菌檢測(cè)方法有:培養(yǎng)和菌落計(jì)數(shù)法,基于免疫學(xué)的方法以及PCR方法。這些方法是依賴于特異性的微生物和生化鑒定,因此只能實(shí)現(xiàn)對(duì)已知菌的定向檢測(cè)。細(xì)菌種類繁多,傳統(tǒng)檢測(cè)方法的局限性造成對(duì)未知菌較高的漏檢率,使得檢測(cè)結(jié)果的可靠性受到一定程度的質(zhì)疑。因此亟需建立一種能夠高效快速準(zhǔn)確檢測(cè)食品中未知細(xì)菌的方法,實(shí)現(xiàn)快速篩查及毒力評(píng)價(jià)的技術(shù)。而生物傳感技術(shù)擁有較高的靈敏度和較強(qiáng)的特異性,特別是細(xì)胞傳感技術(shù)以活細(xì)胞作為識(shí)別元件,可以模擬體內(nèi)的真實(shí)反應(yīng),已經(jīng)在醫(yī)療診斷、藥物篩選、環(huán)境監(jiān)督等領(lǐng)域有廣泛應(yīng)用。因此本研究以革蘭氏陰性菌作為研究對(duì)象,以LPS信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制和AHL分子印跡識(shí)別為理論依據(jù),通過(guò)將電化學(xué)檢測(cè)、重組蛋白制備、磁性分子印跡以及熒光報(bào)告基因轉(zhuǎn)染等手段相結(jié)合構(gòu)建一系列新型靈敏的革蘭氏陰性菌非靶向篩查的傳感新方法與新技術(shù),為食品安全檢測(cè)與評(píng)價(jià)研究提供了一條嶄新的途徑。為探索電化學(xué)細(xì)胞傳感法應(yīng)用于檢測(cè)革蘭氏陰性菌LPS激活RAW264.7細(xì)胞釋放NO的過(guò)程。采用電沉積法在金電極表面修飾鉑納米粒子,創(chuàng)新性的結(jié)合新型高分子碳納米材料氧化石墨烯,制備具有良好生物相容性和機(jī)械強(qiáng)度良好的海藻酸鈉/氧化石墨烯凝膠,將RAW264.7細(xì)胞固定在已修飾的電極表面形成細(xì)胞3D培養(yǎng)系統(tǒng)。以RAW264.7細(xì)胞為識(shí)別元件構(gòu)建細(xì)胞電化學(xué)傳感器,通過(guò)對(duì)LPS的高靈敏檢測(cè),實(shí)現(xiàn)對(duì)革蘭氏陰性菌的間接檢測(cè)。該傳感器在10-2 ng/m L到1 ng/m L濃度范圍內(nèi),LPS濃度與峰電流值呈良好的線性關(guān)系,線性方程為y=9.035x+53.578,R2=0.9842;在1 ng/m L到10 ng/mL濃度范圍內(nèi),LPS濃度與峰電流值呈良好的線性關(guān)系,線性方程為y=0.4778x+53.756,R2=0.9941;在10 ng/mL到104 ng/m L濃度范圍內(nèi),LPS濃度與峰電流值呈良好的線性關(guān)系,線性方程為y=10.019x+50.3,R2=0.9732。LPS的最低檢測(cè)限為8 pg/mL。驗(yàn)證了該3D細(xì)胞電化學(xué)傳感器用于檢測(cè)革蘭氏陰性菌LPS的可行性,實(shí)現(xiàn)了對(duì)革蘭氏陰性菌這一類菌的間接檢測(cè)。為了滿足對(duì)革蘭氏陰性菌快速、靈敏、主動(dòng)的直接檢測(cè)的需求。利用RBL-2H3細(xì)胞表面的大量天然高親和力IgE受體(FcεRI),結(jié)合通過(guò)重組蛋白技術(shù)人工合成的毒力因子受體CD14-Fcε嵌合蛋白,創(chuàng)新性的將熒光檢測(cè)技術(shù)通過(guò)基因編碼鈣離子指示劑GCaMPs與生物離子傳感串聯(lián)運(yùn)用到革蘭氏陰性菌及LPS刺激IgE介導(dǎo)RBL-2H3細(xì)胞中鈣離子信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的檢測(cè)中。該傳感器在101 CFU/m L~103 CFU/m L的濃度范圍內(nèi),隨著大腸桿菌ATCC 25922濃度的增加,細(xì)胞傳感器的相對(duì)熒光強(qiáng)度不斷增大,線性方程為y=1.4081x+0.0332,R2=0.9728。大腸桿菌ATCC 25922的檢測(cè)限為102 CFU/m L。選用豬肉作為食品樣品用于實(shí)際樣品中革蘭氏陰性菌的檢測(cè)。同空白對(duì)照組比較,濃度為102 CFU/mL的大腸桿菌ATCC 25922、鼠傷寒沙門(mén)氏菌ATCC 14028、痢疾志賀氏菌ATCC 3313刺激熒光RBL-2H3細(xì)胞傳感器產(chǎn)生的相對(duì)熒光強(qiáng)度均有顯著性的增加。以上結(jié)果充分證明了該細(xì)胞傳感器用于革蘭氏陰性菌這一類細(xì)菌直接檢測(cè)的可行性,并且檢測(cè)時(shí)間短。為了進(jìn)一步實(shí)現(xiàn)對(duì)革蘭氏陰性腐敗菌的檢測(cè),通過(guò)溶劑熱法合成了Fe3O4磁珠,創(chuàng)新性的以革蘭氏陰性菌群體感應(yīng)信號(hào)分子類似物(呋喃酮)為模板分子,將Fe3O4 MNPs作為內(nèi)核,SiO2作為外殼,氨基化該核殼型磁球,并在其表面聚合,制備分子印跡聚合物微球Fe3O4@SiO2-MIP。通過(guò)磁吸附作用,實(shí)現(xiàn)磁性分子印跡聚合物在磁性電極表面的固定,得到檢測(cè)革蘭氏陰性菌群體感應(yīng)信號(hào)分子的磁性分子印跡電化學(xué)傳感器。采用磁性電極吸附Fe3O4@SiO2-MIP并進(jìn)行電化學(xué)分析,DMHF濃度在2.5×10-9~1.0×10-7mol/L范圍內(nèi)與電流存在良好的線性關(guān)系(R2=0.9915),線性方程為y=-0.3095x+90.967,檢測(cè)限為8×10-10 mol/L。研究了7種細(xì)菌上清液,在大腸桿菌O157:H7,鼠傷寒沙門(mén)氏菌ATCC 14028或金黃色葡萄球菌ATCC 29213的上清液中沒(méi)有檢測(cè)到AHL,此結(jié)果與這些菌不產(chǎn)生AHL的特性相一致。說(shuō)明該法測(cè)定AHL的可行性和特異性。分別對(duì)嗜水氣單胞菌無(wú)菌上清液和銅綠假單胞菌無(wú)菌上清液中群體感應(yīng)信號(hào)分子進(jìn)行檢測(cè),回收率在96.1%~103.4%范圍內(nèi),滿足檢測(cè)要求。RSD值小于2.72%,在誤差允許的范圍內(nèi),說(shuō)明該法測(cè)定AHL的數(shù)據(jù)可信。驗(yàn)證了該磁性分子印跡電化學(xué)傳感器用于革蘭氏陰性腐敗菌間接檢測(cè)的可行性。僅僅完成對(duì)未知細(xì)菌的檢測(cè)還是遠(yuǎn)遠(yuǎn)不夠的,識(shí)別其毒力的大小才是最終目的。創(chuàng)新性的在NF-kB識(shí)別元件后連接一段熒光蛋白基因(mCherry)構(gòu)建融合質(zhì)粒,通過(guò)脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染將pGL4.26-mcherry-NF-κB質(zhì)粒導(dǎo)入293/hTLR4A-MD2-CD14細(xì)胞中,構(gòu)建能表達(dá)紅色熒光的293/hTLR4A-MD2-CD14細(xì)胞傳感器。采用熱酚水法提取14種革蘭氏陰性菌的LPS,進(jìn)行SDS-PAGE銀染分析,并用其刺激所構(gòu)建的敏感細(xì)胞模型,對(duì)所誘導(dǎo)的熒光和炎癥因子分泌的情況進(jìn)行比較分析。以20 h為刺激的時(shí)間終點(diǎn),隨著LPS濃度的增加,大腸桿菌、鼠傷寒沙門(mén)氏菌、阪崎腸桿菌、痢疾志賀氏菌和銅綠假單胞菌LPS刺激組的熒光強(qiáng)度逐漸增加,TNF-α和IL-8的分泌量也逐漸增加。在同樣濃度的LPS刺激下,銅綠假單胞菌(假單胞菌科)LPS刺激組的熒光強(qiáng)度明顯低于其他細(xì)菌(腸桿菌科)LPS刺激組,這與銅綠假單胞菌五�；腖ipid A結(jié)構(gòu)有關(guān)。驗(yàn)證了該細(xì)胞傳感器評(píng)價(jià)革蘭氏陰性菌LPS毒力大小的可行性。腸道上皮細(xì)胞是粘膜表面對(duì)細(xì)菌入侵的最早的傳感器,因此研究腸道細(xì)胞對(duì)LPS的反應(yīng)非常有意義。以蛋白免疫印跡、流式細(xì)胞術(shù)、RT-PCR等為技術(shù)手段,以檢測(cè)蛋白表達(dá)及炎癥因子表達(dá)為客觀指標(biāo),首先研究了三種人腸道上皮細(xì)胞Caco-2,HT29,SW480 TLR4的表達(dá)的情況,以及腸道上皮細(xì)胞對(duì)LPS的反應(yīng)。隨后將腸道上皮細(xì)胞Caco-2,HT29,SW480分別與巨噬細(xì)胞THP-1共培養(yǎng),模擬機(jī)體內(nèi)腸道上皮細(xì)胞與固有層MΦ的“對(duì)話”,創(chuàng)新性的研究了LPS刺激共培養(yǎng)體系下,腸道上皮細(xì)胞TLR4的表達(dá)情況,以及腸道上皮細(xì)胞對(duì)LPS的反應(yīng)。結(jié)果表明,在單獨(dú)培養(yǎng)條件下,Caco-2細(xì)胞不表達(dá)TLR4,HT29細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)內(nèi)表達(dá)TLR4,SW480細(xì)胞細(xì)胞表面表達(dá)TLR4。LPS刺激24 h后,Caco-2,HT29,SW480細(xì)胞TLR4的表達(dá)均不增加。Caco-2和HT29細(xì)胞對(duì)LPS無(wú)反應(yīng),SW480細(xì)胞對(duì)LPS有反應(yīng)。在LPS刺激24 h共培養(yǎng)體系下,HT29和SW480細(xì)胞的TLR4表達(dá)均無(wú)顯著性增加,而Caco-2細(xì)胞的TLR4表達(dá)顯著性增加。HT29細(xì)胞對(duì)LPS無(wú)反應(yīng),SW480細(xì)胞和Caco-2細(xì)胞對(duì)LPS有反應(yīng)。因此,SW480細(xì)胞是LPS刺激的敏感腸道細(xì)胞模型。探索了LPS刺激腸道細(xì)胞的反應(yīng)機(jī)制,為篩選出LPS刺激的敏感腸道細(xì)胞模型提供理論基礎(chǔ),為下一步構(gòu)建腸道共培養(yǎng)模型提供新的思路。綜上,本論文主要圍繞生物傳感技術(shù)在革蘭氏陰性菌非靶向篩查中的應(yīng)用進(jìn)行研究。以革蘭氏陰性菌為檢測(cè)對(duì)象,結(jié)合電化學(xué)檢測(cè)、重組蛋白制備、熒光報(bào)告基因轉(zhuǎn)染以及磁性分子印跡等技術(shù)構(gòu)建了一系列新型、主動(dòng)、真實(shí)的生物傳感檢測(cè)評(píng)價(jià)方法,并用于實(shí)際樣品檢測(cè)中,為生物傳感識(shí)別水平的提高和食品安全檢測(cè)評(píng)價(jià)技術(shù)的發(fā)展提供了有力的保障和支持。
【學(xué)位授予單位】：江南大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：TP212.3;TS207.4

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中國(guó)博士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前1條

1 蔣卉;基于生物傳感器的革蘭氏陰性菌非靶向篩查技術(shù)研究[D];江南大學(xué);2017年

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本文編號(hào)：1269921