發(fā)布時間：2017-12-05 18:14

  本文關(guān)鍵詞：重組大腸桿菌全細(xì)胞轉(zhuǎn)化L-苯丙氨酸合成苯丙酮酸的研究

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【摘要】：α-苯丙酮酸(PPA)是一種多功能有機酸,廣泛應(yīng)用于制藥、食品、化學(xué)工業(yè)。傳統(tǒng)的化學(xué)制備法環(huán)境污染嚴(yán)重,微生物發(fā)酵法產(chǎn)量低。對于生物轉(zhuǎn)化法,一般采用D-氨基酸氧化酶(D-AAO)催化D-苯丙氨酸合成PPA,反應(yīng)過程中生成毒性副產(chǎn)物過氧化氫。來自Proteus.sp的L-氨基酸脫氨酶(L-AADs)可特異性催化L-苯丙氨酸(PLA)氧化脫氨基合成PPA,不生成過氧化氫且PLA比D-苯丙氨酸價格便宜。本論文中,在Escherichia coli BL21(DE3)中異源表達(dá)了來自Proteus mirabilis KCTC 2566的膜結(jié)合L-氨基酸脫氨酶(L-AAD),構(gòu)建的重組菌株生長態(tài)和靜止態(tài)兩階段全細(xì)胞轉(zhuǎn)化PLA合成PPA。主要結(jié)果如下:(1)在E.coli BL21(DE3)中過量表達(dá)來自Proteus mirabilis KCTC 2566的L-AAD,對誘導(dǎo)條件進(jìn)行了優(yōu)化,提高了L-AAD表達(dá)量。對L-AAD純化步驟(去垢劑種類、是否超高速離心、緩沖液成分)進(jìn)行了優(yōu)化,最終L-AAD純化了52倍,整體得率13%,比酶活0.94±0.01μmol PPA·min~(-1)·mg蛋白~(-1)。然后利用純酶L-AAD一步法轉(zhuǎn)化PLA合成PPA,并對轉(zhuǎn)化條件進(jìn)行了優(yōu)化。最優(yōu)純酶轉(zhuǎn)化條件(0.2 mg·m L~(-1) L-AAD,3.0g·L~(-1) PLA,5 mmol·L~(-1) FAD,p H 7.4,35°C)下,轉(zhuǎn)化2.5 h,PPA產(chǎn)量為2.6±0.1g·L~(-1),轉(zhuǎn)化率為86.7%,合成效率為1.0 g·L~(-1)·h~(-1)。(2)通過兩階段全細(xì)胞轉(zhuǎn)化(生長態(tài)細(xì)胞轉(zhuǎn)化和靜止態(tài)細(xì)胞轉(zhuǎn)化),利用重組E.coli轉(zhuǎn)化PLA合成PPA。首先,對搖瓶生長態(tài)細(xì)胞轉(zhuǎn)化條件進(jìn)行了優(yōu)化(PLA濃度10g·L~(-1),溫度35°C),并建立了兩階段溫度控制策略(即前12 h,20°C低溫誘導(dǎo),然后向系統(tǒng)中添加PLA,并提高溫度至35°C,直到反應(yīng)結(jié)束),轉(zhuǎn)化16 h,PPA產(chǎn)量為7.2±0.4 g·L~(-1),PLA轉(zhuǎn)化率為72.0%。然后對靜止態(tài)細(xì)胞轉(zhuǎn)化條件進(jìn)行了優(yōu)化(4 g·L~(-1)PLA,1.2 g·L~(-1)細(xì)胞催化劑,p H 7.4,40°C),轉(zhuǎn)化6 h,PPA產(chǎn)量為3.3±0.2 g·L~(-1),PLA轉(zhuǎn)化率為82.5%。分別從PPA產(chǎn)量、底物轉(zhuǎn)化率、合成效率、穩(wěn)定性、是否需要外加輔酶、可重復(fù)使用性這些方面,比較了酶轉(zhuǎn)化和全細(xì)胞轉(zhuǎn)化。(3)對3 L罐上兩階段全細(xì)胞轉(zhuǎn)化條件進(jìn)行了優(yōu)化。生長態(tài)細(xì)胞轉(zhuǎn)化最優(yōu)PLA濃度為30 g·L~(-1),反應(yīng)6 h,達(dá)到最大PPA產(chǎn)量21.5±1.3 g·L~(-1),底物轉(zhuǎn)化率71.7%。然后對靜止態(tài)細(xì)胞轉(zhuǎn)化條件進(jìn)行了優(yōu)化(攪拌轉(zhuǎn)速500 rpm,通氣量1.5 vvm,PLA濃度15 g·L~(-1)),3 h內(nèi)底物轉(zhuǎn)化率100%。結(jié)合影響罐上靜止態(tài)細(xì)胞轉(zhuǎn)化過程的三個主要因素(細(xì)胞失活、底物抑制、產(chǎn)物抑制),構(gòu)建了靜止態(tài)細(xì)胞轉(zhuǎn)化的動力學(xué)模型。經(jīng)過驗證,模型能夠較精確地預(yù)測實驗結(jié)果。(4)針對全細(xì)胞催化劑的副反應(yīng)及L-AAD活性低的問題,結(jié)合PPA降解途徑改造和L-AAD分子改造,提高了全細(xì)胞催化能力和PPA產(chǎn)量。首先,敲除了三種催化PPA降解的氨基酸轉(zhuǎn)氨酶,靜止態(tài)細(xì)胞轉(zhuǎn)化PPA產(chǎn)量從3.3±0.2 g·L~(-1)提高到3.9±0.1g·L~(-1),底物轉(zhuǎn)化率達(dá)到97.5%。然后通過易錯PCR結(jié)合定點飽和突變提高全細(xì)胞催化性能。三點突變體D165K/F263M/L336M有最高的靜止態(tài)細(xì)胞轉(zhuǎn)化PPA產(chǎn)量10.0±0.4g·L~(-1),底物轉(zhuǎn)化率為100%,是野生型的3倍。改造菌株搖瓶生長態(tài)和靜止態(tài)細(xì)胞轉(zhuǎn)化PPA產(chǎn)量分別為19.8±2.3 g·L~(-1)和10.0±0.2 g·L~(-1);3 L罐上生長態(tài)和靜止態(tài)細(xì)胞轉(zhuǎn)化PPA產(chǎn)量分別為45.1±2.1 g·L~(-1)和30.0±1.2 g·L~(-1)。(5)通過代謝改造加強E.coli FAD合成和再生系統(tǒng)提高全細(xì)胞活性。首先,向培養(yǎng)基中額外添加FAD,PPA產(chǎn)量提高,證明輔酶濃度是L-AAD催化的限制性步驟。然后過量表達(dá)和微調(diào)FAD合成途徑關(guān)鍵基因(rib H、rib C、rib F),提高轉(zhuǎn)化初始胞內(nèi)FAD濃度,靜止態(tài)細(xì)胞轉(zhuǎn)化PPA產(chǎn)量提高了90%(19.4±1.1 g·L~(-1))。然后構(gòu)建了FADH2/FAD再生系統(tǒng),表達(dá)了甲酸脫氫酶和NADH氧化酶,加強了FADH2/FAD再生速率。重組菌株搖瓶生長態(tài)和靜止態(tài)細(xì)胞轉(zhuǎn)化PPA產(chǎn)量分別為57.1±2.3 g·L~(-1)和34.4±1.1 g·L~(-1);3 L罐上生長態(tài)和靜止態(tài)細(xì)胞轉(zhuǎn)化PPA產(chǎn)量分別為75.3±4.3 g·L~(-1)和58.4±3.2 g·L~(-1)。
【學(xué)位授予單位】：江南大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：TQ921

【參考文獻(xiàn)】

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1 陳e，

本文編號：1255724