本文關(guān)鍵詞：產(chǎn)絮菌Agrobacterium tumefaciens F2利用混合碳源半連續(xù)發(fā)酵制備生物絮凝劑

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【摘要】：生物絮凝劑是近年來備受關(guān)注的一種無毒害、無二次污染及可生物降解的綠色凈水劑,潛在的環(huán)境效益使其在水處理領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景。目前生物絮凝劑工業(yè)化生產(chǎn)面臨的主要問題是產(chǎn)量偏低及發(fā)酵方式單一。基于此,本研究以生物絮凝劑產(chǎn)生菌Agrobacterium tumefaciens F2為研究對(duì)象,分析菌株生理水平對(duì)單糖的跨膜傳輸及磷酸化反應(yīng)特性,構(gòu)建葡萄糖、半乳糖、甘露糖混合碳源的產(chǎn)量預(yù)測(cè)模型,選取菌絲球?yàn)樯镔|(zhì)載體固定化產(chǎn)絮菌株F2開發(fā)新型發(fā)酵方法。首先考察了產(chǎn)絮菌株Agrobacterium tumefaciens F2以葡萄糖、半乳糖、甘露糖為單一碳源時(shí)的跨膜傳輸特性及磷酸化反應(yīng)速率。采用高效液相色譜法定量檢測(cè)單糖,依據(jù)細(xì)胞反應(yīng)動(dòng)力學(xué)、酶促反應(yīng)米氏方程、滲透系數(shù)等基本理論,考察不同初始濃度對(duì)菌株生理水平跨膜及磷酸化反應(yīng)速率的影響。結(jié)果表明,在25 mmol/L-150 mmol/L濃度范圍內(nèi),100 mmol/L的跨膜傳輸速率最佳,發(fā)酵至18 h達(dá)到最大值,單糖跨膜傳輸?shù)闹萍s因素是細(xì)胞膜載體蛋白的結(jié)合能力及胞外底物濃度;三種單糖初始濃度在10-30 mmol/L條件下,半乳糖磷酸化反應(yīng)速率低于葡萄糖和甘露糖的數(shù)值,證明產(chǎn)絮菌株F2細(xì)胞中的半乳糖激酶活性低于己糖激酶;滲透系數(shù)隨初始底物濃度增加逐漸降低,24 h達(dá)到最大值,與各單糖跨膜傳輸速率是相輔相成、相互制約的整體。通過產(chǎn)絮菌株F2利用單一碳源葡萄糖、半乳糖、甘露糖及三種單糖的混合碳源的生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)分析,明確三種單糖混合發(fā)酵的最佳初始濃度為9 g/L,配比為5:1:3。采用BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建三種單糖初始濃度對(duì)應(yīng)絮凝效能、絮凝劑產(chǎn)量的預(yù)測(cè)模型,優(yōu)化所得最優(yōu)解分別是葡萄糖6.59 g/L、半乳糖1.32 g/L、甘露糖3.57 g/L,預(yù)測(cè)絮凝效能及產(chǎn)量最大值為96.91%和2.93 g/L,顯著高于單一碳源發(fā)酵的產(chǎn)量(1.78 g/L);經(jīng)柱前衍生化方法測(cè)定三種單糖混合發(fā)酵時(shí)的利用規(guī)律,結(jié)合生長(zhǎng)曲線可知,在對(duì)數(shù)期前期,葡萄糖為菌株的主要產(chǎn)能碳源,在對(duì)數(shù)期后期(14-18 h)及穩(wěn)定期前期(18-26 h)三種單糖直接合成大量絮凝劑,24 h產(chǎn)量達(dá)最大值(2.93 g/L),這是由產(chǎn)絮菌株F2對(duì)單糖的跨膜傳輸及磷酸化反應(yīng)特性決定的。計(jì)算產(chǎn)絮過程的碳源轉(zhuǎn)化率,混合碳源發(fā)酵的菌體生物量及多糖類聚合物分別是21%和33%,遠(yuǎn)高于葡萄糖、半乳糖、甘露糖單一碳源發(fā)酵時(shí)的轉(zhuǎn)化率(菌體轉(zhuǎn)化率約10%,絮凝劑轉(zhuǎn)化率20%左右)。全部結(jié)果證明混合碳源發(fā)酵可促進(jìn)菌株合成絮凝劑的產(chǎn)量及碳源轉(zhuǎn)化率提高。以黑曲霉Aspergillus nige Y3菌絲球作為載體,實(shí)現(xiàn)了產(chǎn)絮菌株F2的固定化及半連續(xù)發(fā)酵制備生物絮凝劑。菌絲球載體在產(chǎn)絮菌培養(yǎng)基中生長(zhǎng)良好,通過吸附法可成功固定化產(chǎn)絮菌株F2,經(jīng)連續(xù)轉(zhuǎn)接后球體形態(tài)穩(wěn)定,且附著的細(xì)菌生物量逐漸增多,歸功于產(chǎn)絮菌分泌的多糖絮凝劑,單批次發(fā)酵的吸附量約為8.75×109 cfu/g菌絲球干重。采用響應(yīng)面分析法優(yōu)化固定化發(fā)酵的培養(yǎng)條件,最優(yōu)結(jié)果是接種量8%,發(fā)酵時(shí)間27 h,經(jīng)驗(yàn)證可得3.24 g/L的絮凝劑,相較于游離發(fā)酵的產(chǎn)量(2.93 g/L)提高了近10%。進(jìn)一步優(yōu)化了絮凝劑干粉的絮凝條件,預(yù)測(cè)最佳結(jié)果是干粉投加量0.03 g/L,Ca Cl2投加量1 m L/L,環(huán)境p H=8,絮凝效能可達(dá)97.98%,經(jīng)反復(fù)驗(yàn)證證明兩個(gè)模型具有較高的精準(zhǔn)度。分析了固定化發(fā)酵單周期的產(chǎn)絮效能,菌體生長(zhǎng)周期與游離發(fā)酵基本保持一致,26 h可收獲最大產(chǎn)量(3.35 g/L)。將固定化產(chǎn)絮菌的菌絲球連續(xù)傳代培養(yǎng),結(jié)果證實(shí)至少可轉(zhuǎn)接30個(gè)周期(24 h/周期),并可同時(shí)保證菌體生物量、絮凝效能及絮凝劑產(chǎn)量三者的穩(wěn)定性。綜上所述,為促進(jìn)產(chǎn)絮菌株F2的產(chǎn)量提高及開發(fā)新型發(fā)酵方法,本研究圍繞菌株對(duì)葡萄糖、半乳糖、甘露糖的利用規(guī)律,構(gòu)建葡萄糖、半乳糖、甘露糖三者混合使用時(shí)的產(chǎn)量預(yù)測(cè)模型,并以菌絲球?yàn)樯镔|(zhì)載體實(shí)現(xiàn)了固定化產(chǎn)絮菌株F2的半連續(xù)發(fā)酵。意義在于提高了產(chǎn)絮菌株F2的碳源轉(zhuǎn)化率及絮凝劑產(chǎn)量,為混合碳源制備生物絮凝劑奠定基礎(chǔ);半連續(xù)發(fā)酵方法可有效保證發(fā)酵系統(tǒng)的菌體生物量、增強(qiáng)菌體抗性、免除種子液制備及接種步驟,菌絲球生物質(zhì)載體的選用便于后續(xù)固液分離及載體處理。研究結(jié)果表明,產(chǎn)絮菌株F2利用混合碳源的半連續(xù)發(fā)酵可促進(jìn)產(chǎn)量提高,并為工業(yè)化發(fā)酵方式提供了新思路。
【學(xué)位授予單位】：哈爾濱工業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：X703.5;X172

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