本文關鍵詞：產絮菌Agrobacterium tumefaciens F2利用混合碳源半連續(xù)發(fā)酵制備生物絮凝劑

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【摘要】：生物絮凝劑是近年來備受關注的一種無毒害、無二次污染及可生物降解的綠色凈水劑,潛在的環(huán)境效益使其在水處理領域具有廣闊的應用前景。目前生物絮凝劑工業(yè)化生產面臨的主要問題是產量偏低及發(fā)酵方式單一�；诖�,本研究以生物絮凝劑產生菌Agrobacterium tumefaciens F2為研究對象,分析菌株生理水平對單糖的跨膜傳輸及磷酸化反應特性,構建葡萄糖、半乳糖、甘露糖混合碳源的產量預測模型,選取菌絲球為生物質載體固定化產絮菌株F2開發(fā)新型發(fā)酵方法。首先考察了產絮菌株Agrobacterium tumefaciens F2以葡萄糖、半乳糖、甘露糖為單一碳源時的跨膜傳輸特性及磷酸化反應速率。采用高效液相色譜法定量檢測單糖,依據細胞反應動力學、酶促反應米氏方程、滲透系數等基本理論,考察不同初始濃度對菌株生理水平跨膜及磷酸化反應速率的影響。結果表明,在25 mmol/L-150 mmol/L濃度范圍內,100 mmol/L的跨膜傳輸速率最佳,發(fā)酵至18 h達到最大值,單糖跨膜傳輸的制約因素是細胞膜載體蛋白的結合能力及胞外底物濃度;三種單糖初始濃度在10-30 mmol/L條件下,半乳糖磷酸化反應速率低于葡萄糖和甘露糖的數值,證明產絮菌株F2細胞中的半乳糖激酶活性低于己糖激酶;滲透系數隨初始底物濃度增加逐漸降低,24 h達到最大值,與各單糖跨膜傳輸速率是相輔相成、相互制約的整體。通過產絮菌株F2利用單一碳源葡萄糖、半乳糖、甘露糖及三種單糖的混合碳源的生長動力學分析,明確三種單糖混合發(fā)酵的最佳初始濃度為9 g/L,配比為5:1:3。采用BP神經網絡構建三種單糖初始濃度對應絮凝效能、絮凝劑產量的預測模型,優(yōu)化所得最優(yōu)解分別是葡萄糖6.59 g/L、半乳糖1.32 g/L、甘露糖3.57 g/L,預測絮凝效能及產量最大值為96.91%和2.93 g/L,顯著高于單一碳源發(fā)酵的產量(1.78 g/L);經柱前衍生化方法測定三種單糖混合發(fā)酵時的利用規(guī)律,結合生長曲線可知,在對數期前期,葡萄糖為菌株的主要產能碳源,在對數期后期(14-18 h)及穩(wěn)定期前期(18-26 h)三種單糖直接合成大量絮凝劑,24 h產量達最大值(2.93 g/L),這是由產絮菌株F2對單糖的跨膜傳輸及磷酸化反應特性決定的。計算產絮過程的碳源轉化率,混合碳源發(fā)酵的菌體生物量及多糖類聚合物分別是21%和33%,遠高于葡萄糖、半乳糖、甘露糖單一碳源發(fā)酵時的轉化率(菌體轉化率約10%,絮凝劑轉化率20%左右)。全部結果證明混合碳源發(fā)酵可促進菌株合成絮凝劑的產量及碳源轉化率提高。以黑曲霉Aspergillus nige Y3菌絲球作為載體,實現(xiàn)了產絮菌株F2的固定化及半連續(xù)發(fā)酵制備生物絮凝劑。菌絲球載體在產絮菌培養(yǎng)基中生長良好,通過吸附法可成功固定化產絮菌株F2,經連續(xù)轉接后球體形態(tài)穩(wěn)定,且附著的細菌生物量逐漸增多,歸功于產絮菌分泌的多糖絮凝劑,單批次發(fā)酵的吸附量約為8.75×109 cfu/g菌絲球干重。采用響應面分析法優(yōu)化固定化發(fā)酵的培養(yǎng)條件,最優(yōu)結果是接種量8%,發(fā)酵時間27 h,經驗證可得3.24 g/L的絮凝劑,相較于游離發(fā)酵的產量(2.93 g/L)提高了近10%。進一步優(yōu)化了絮凝劑干粉的絮凝條件,預測最佳結果是干粉投加量0.03 g/L,Ca Cl2投加量1 m L/L,環(huán)境p H=8,絮凝效能可達97.98%,經反復驗證證明兩個模型具有較高的精準度。分析了固定化發(fā)酵單周期的產絮效能,菌體生長周期與游離發(fā)酵基本保持一致,26 h可收獲最大產量(3.35 g/L)。將固定化產絮菌的菌絲球連續(xù)傳代培養(yǎng),結果證實至少可轉接30個周期(24 h/周期),并可同時保證菌體生物量、絮凝效能及絮凝劑產量三者的穩(wěn)定性。綜上所述,為促進產絮菌株F2的產量提高及開發(fā)新型發(fā)酵方法,本研究圍繞菌株對葡萄糖、半乳糖、甘露糖的利用規(guī)律,構建葡萄糖、半乳糖、甘露糖三者混合使用時的產量預測模型,并以菌絲球為生物質載體實現(xiàn)了固定化產絮菌株F2的半連續(xù)發(fā)酵。意義在于提高了產絮菌株F2的碳源轉化率及絮凝劑產量,為混合碳源制備生物絮凝劑奠定基礎;半連續(xù)發(fā)酵方法可有效保證發(fā)酵系統(tǒng)的菌體生物量、增強菌體抗性、免除種子液制備及接種步驟,菌絲球生物質載體的選用便于后續(xù)固液分離及載體處理。研究結果表明,產絮菌株F2利用混合碳源的半連續(xù)發(fā)酵可促進產量提高,并為工業(yè)化發(fā)酵方式提供了新思路。
【學位授予單位】：哈爾濱工業(yè)大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：X703.5;X172

【參考文獻】

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