本文關鍵詞：重組水蛭素的聚乙二醇修飾及其反應動力學

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【摘要】：藥用蛋白質具有活性高、特異性強、生物功能明確等優(yōu)點,已成為生物醫(yī)藥產業(yè)發(fā)展的熱點,但臨床上仍存在半衰期短、免疫原性強、穩(wěn)定性差等缺陷。因此研發(fā)長效劑型成為新的發(fā)展趨勢,其中聚乙二醇(PEG)修飾是研發(fā)長效藥用蛋白質最為成功的方法。聚乙二醇修飾具有延長藥用蛋白質在體內的半衰期、降低免疫原性和延緩蛋白酶降解、提高穩(wěn)定性和溶解性等優(yōu)點。然而,PEG修飾藥用蛋白質仍然面臨降低修飾劑損失、控制修飾位點和修飾度等難題。為解決上述問題,以重組水蛭素作為模型藥用蛋白質,建立了PEG修飾重組水蛭素的反應動力學模型,考察了體系的溶劑環(huán)境、離子交換柱原位修飾和不同PEG修飾劑的影響。主要研究結果如下：(1)建立了PEG修飾重組水蛭素的反應動力學模型,并將其應用于修飾反應的條件優(yōu)化,獲得了幾個關鍵參數(shù)(ymax、mcrit和tmax)的通用表達式,確定了影響單修飾產物得率的關鍵因素。結果表明,所構建的反應動力學模型不僅能解釋PEG修飾重組水蛭素的反應機理,而且能用于PEG修飾蛋白質過程的優(yōu)化控制。(2)考察了水-有機溶劑混合溶液對PEG修飾重組水蛭素的影響。通過對重組水蛭素的結構、PEG修飾劑的水解動力學和修飾反應動力學的分析表明,水-有機溶劑混合溶液能通過溶劑化效應(PEG修飾加速和PEG水解抑制)提高PEG修飾的效率。根據(jù)占主導的溶劑化效應,可將水-有機溶劑混合溶液反應體系分為三種類型：PEG修飾加速驅動型、PEG水解抑制驅動型、PEG修飾加速與PEG水解抑制共同驅動型。用水-二甲基亞砜混合溶液獲得理想得率(約50%)的單修飾產物時,PEG修飾劑用量比純水溶液降低3-5倍。(3)建立了離子交換柱原位修飾重組水蛭素的工藝,使PEG修飾與產物分離純化在同一個單元操作中完成,實現(xiàn)反應與分離的過程集成�？疾炝瞬煌x子交換樹脂介質對原位修飾的影響,結果表明樹脂的孔徑和內部表面結構(如結合高分子的葡聚糖)對PEG修飾的影響較大。考察了不同PEG分子量對原位修飾的影響,結果表明離子交換柱原位修飾(固相修飾)是擴散控制的過程,其單修飾產物的理論得率隨PEG分子量增大而降低,這與液相修飾正好相反。單修飾產物的體外、體內活性分析表明,離子交換柱原位修飾能提高PEG修飾的選擇性,其單修飾產物的體外和體內抗凝活性比液相修飾更高。(4)采用分枝型mPEG2-NHS制備高得率、高活性保留率的單修飾產物。PEG修飾劑的水解動力學和修飾反應動力學表明,分枝型mPEG2-NHS修飾重組水蛭素的反應速度比直線型mPEG-SC稍慢,而其自身失活速度卻比mPEG-SC快的多,獲得理想得率的單修飾產物的PEG修飾劑用量更大。單修飾產物的體外、體內活性分析表明,分枝型mPEG2-NHS比線型mPEG-SC更容易保護重組水蛭素的活性位點不被修飾,獲得的單修飾產物體外抗凝活性更高,體內的藥效更強。(5)應用響應面分析法優(yōu)化了mPEG-ALD定點修飾重組水蛭素N末端的反應條件。結果表明,mPEG-ALD定點修飾比nPEG-SC隨機修飾重組水蛭素得到的單修飾產物的修飾位點更均一,理論得率更高。定點修飾得到的單修飾產物仍能保留重組水蛭素20%左右的體外抗凝活性。綜上所述,以PEG修飾藥用蛋白質反應動力學模型為基礎,通過系統(tǒng)研究微環(huán)境因子對PEG修飾藥用蛋白質的影響,能減少PEG修飾劑的用量并有效控制藥用蛋白的PEG修飾位點和修飾度,為高效制備PEG修飾藥用蛋白質提供了新的思路。
【學位授予單位】：大連理工大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：TQ460.1
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本文編號：1186572