本文關(guān)鍵詞：乳酸菌發(fā)酵特性及其蛋白酶對(duì)凝乳品質(zhì)影響研究

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【摘要】：乳酸菌蛋白酶直接作用于乳中的酪蛋白,是乳酸菌降解系統(tǒng)的第一步,對(duì)乳酸菌在乳中的生長至關(guān)重要,對(duì)發(fā)酵乳制品風(fēng)味和質(zhì)地的形成以及品質(zhì)具有重要的影響。本論文以實(shí)驗(yàn)室從傳統(tǒng)發(fā)酵食品中分離的乳酸菌為研究對(duì)象,確定具有促進(jìn)凝乳質(zhì)量蛋白酶的乳酸菌,研究其蛋白酶性質(zhì)及其對(duì)凝乳理化性質(zhì)和凝塊品質(zhì)的影響,旨在通過研究乳酸菌蛋白酶特性來選擇優(yōu)良酸奶生產(chǎn)用菌種,為高品質(zhì)發(fā)酵乳的生產(chǎn)提供理論依據(jù)和基礎(chǔ)。通過對(duì)現(xiàn)有乳酸菌發(fā)酵乳的質(zhì)構(gòu)分析,發(fā)現(xiàn)123株乳酸菌中有69株具有結(jié)實(shí)的凝乳效果,依據(jù)這69株乳酸菌蛋白水解度的不同,篩選出12株凝乳結(jié)實(shí)且蛋白水解度高的乳酸菌,并對(duì)篩選菌株的蛋白水解力和蛋白酶活力進(jìn)行研究,發(fā)現(xiàn)同一種屬的不同菌株水解蛋白的能力也存在顯著差異。分析篩選菌株的蛋白水解度和發(fā)酵性能,發(fā)現(xiàn)中等程度的蛋白水解有利于凝膠硬度的增加,而發(fā)酵乳表觀黏度隨著蛋白水解度的增加而降低,菌株蛋白水解度對(duì)發(fā)酵乳粒度的影響不顯著。通過研究這12株乳酸菌蛋白酶粗酶對(duì)葡萄糖酸內(nèi)酯(GDL)乳凝膠質(zhì)量的影響,篩選出3株對(duì)GDL乳凝膠質(zhì)量促進(jìn)作用最顯著的菌株CH9-3 4.0、SH3 4.3和SB5。經(jīng)16S r DNA序列分析和API細(xì)菌鑒定系統(tǒng),確定這3株菌屬于德氏乳桿菌保加利亞亞種。為獲得上述3株保加利亞乳桿菌蛋白酶,本論文對(duì)分離純化的方法和參數(shù)條件進(jìn)行了優(yōu)化,確定了最適合乳酸菌蛋白酶提取純化的方法和條件。乳酸菌細(xì)胞經(jīng)溶菌酶處理獲得胞外蛋白酶,再經(jīng)超濾濃縮獲得粗酶液,依次進(jìn)行DEAE弱陰離子交換層析和Hi Trap Butyl弱疏水層析。最終得到電泳純的保加利亞乳桿菌CH9-3 4.0、SH3 4.3和SB5蛋白酶,其分子量分別為39、40和52 k Da,得率分別為46.6%、39.3%和40.4%,分別被純化了42.8、32.6和31.9倍,純化后各菌株蛋白酶的比酶活分別為54.4,80.3和61.1 U/mg。研究上述3株保加利亞乳桿菌純化蛋白酶的酶學(xué)性質(zhì),結(jié)果表明,這3株乳酸菌純化蛋白酶的最適反應(yīng)溫度均為42℃,在4~50℃比較穩(wěn)定;最適反應(yīng)p H均為6.0左右,在p H 5.5~7.0比較穩(wěn)定;Ba2+、Zn2+、Mn2+、Sn2+、Fe3+等離子明顯抑制蛋白酶活力,Fe2+離子顯著增加蛋白酶活力,EDTA和PMSF明顯抑制酶活力,說明這3株保加利亞乳桿菌蛋白酶是金屬離子蛋白酶和絲氨酸蛋白酶。將純化獲得的保加利亞乳桿菌蛋白酶以活力20 U/g蛋白質(zhì)添加到發(fā)酵乳中,利用激光共聚焦、熒光染色、納米激光粒度分析等技術(shù),研究其對(duì)發(fā)酵乳凝膠質(zhì)量的影響,結(jié)果證實(shí)乳酸菌蛋白酶組分可以顯著(P0.05)提高發(fā)酵乳凝膠的凝膠硬度、稠度以及表觀黏度。保加利亞乳桿菌蛋白酶處理能夠明顯增加發(fā)酵乳凝膠樣品聚集體粒徑D(4,3)和D(3,2);顯著(P0.05)降低發(fā)酵乳凝膠樣品蛋白質(zhì)表面負(fù)電荷,促進(jìn)表面電荷達(dá)到靜電平衡;蛋白酶的水解作用顯著(P0.05)增加游離Ca2+含量,而顯著(P0.05)減少凝膠結(jié)構(gòu)中酪蛋白結(jié)合的Ca2+含量;乳酸菌蛋白酶作用后的發(fā)酵乳樣品孔洞小、凝膠結(jié)構(gòu)均勻細(xì)膩、連接緊密;保加利亞乳桿菌蛋白酶對(duì)乳蛋白凝乳作用不同,SH3 4.3蛋白酶作用增加樣品凝膠的黏度和剪切應(yīng)力;CH9-3 4.0蛋白酶作用增加樣品凝膠結(jié)構(gòu)的強(qiáng)度和彈性模量G′。
【關(guān)鍵詞】：乳酸菌 蛋白酶 酶學(xué)性質(zhì) 凝乳 發(fā)酵乳品質(zhì)
【學(xué)位授予單位】：哈爾濱工業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：TS252.1
【目錄】：

• 摘要4-6
• ABSTRACT6-16
• 第1章 緒論16-35
• 1.1 課題背景及研究目的和意義16-17
• 1.2 乳酸菌蛋白酶研究進(jìn)展17-26
• 1.2.1 乳酸菌的蛋白質(zhì)代謝17-18
• 1.2.2 乳酸菌蛋白水解系統(tǒng)18-19
• 1.2.3 酪蛋白的降解19-24
• 1.2.4 乳酸菌蛋白酶性質(zhì)24-26
• 1.3 酸乳凝膠研究進(jìn)展26-32
• 1.3.1 酸凝乳的形成26-27
• 1.3.2 粒子凝膠模型27-28
• 1.3.3 酸凝乳機(jī)制研究28-31
• 1.3.4 影響酸奶凝膠結(jié)構(gòu)的因素31-32
• 1.4 乳酸菌蛋白酶影響乳品質(zhì)量研究進(jìn)展32-34
• 1.4.1 乳酸菌蛋白酶對(duì)乳制品加工的影響32-33
• 1.4.2 蛋白水解對(duì)凝膠質(zhì)量的影響研究33-34
• 1.5 課題來源及主要研究內(nèi)容34-35
• 第2章 實(shí)驗(yàn)材料與方法35-52
• 2.1 實(shí)驗(yàn)材料35-39
• 2.1.1 主要試劑35-37
• 2.1.2 主要儀器和設(shè)備37-38
• 2.1.3 培養(yǎng)基38
• 2.1.4 菌株來源38-39
• 2.2 測定方法39-45
• 2.2.1 OPA法測定蛋白水解度39-40
• 2.2.2 發(fā)酵乳質(zhì)構(gòu)的測定40
• 2.2.3 發(fā)酵乳表觀黏度的測定40
• 2.2.4 聚集體粒子大小的測定40-41
• 2.2.5 SDS-PAGE電泳41-42
• 2.2.6 菌株鑒定42-43
• 2.2.7 細(xì)菌活菌數(shù)的測定43
• 2.2.8 蛋白酶活力測定43
• 2.2.9 凝膠收縮系數(shù)43
• 2.2.10 持水力測定43
• 2.2.11 Zeta電位的測定43-44
• 2.2.12 Ca~(2+)含量的測定44
• 2.2.13 酪蛋白結(jié)構(gòu)觀察44
• 2.2.14 乳凝膠流變學(xué)性質(zhì)分析44-45
• 2.3 實(shí)驗(yàn)方法45-51
• 2.3.1 合成蛋白酶菌株的篩選45-46
• 2.3.2 促進(jìn)凝乳質(zhì)量蛋白酶乳酸菌的篩選及鑒定46
• 2.3.3 蛋白酶的分離46-48
• 2.3.4 蛋白酶酶學(xué)性質(zhì)研究48-49
• 2.3.5 蛋白酶影響凝乳品質(zhì)研究49-51
• 2.4 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)分析51-52
• 第3章 促進(jìn)凝乳質(zhì)量蛋白酶乳酸菌的篩選52-71
• 3.1 引言52-53
• 3.2 合成蛋白酶菌株的篩選53-55
• 3.3 篩選菌株發(fā)酵性分析55-58
• 3.3.1 篩選菌株發(fā)酵乳質(zhì)構(gòu)55-57
• 3.3.2 篩選菌株發(fā)酵乳表觀黏度57
• 3.3.3 篩選菌株發(fā)酵乳粒度57-58
• 3.4 篩選菌株蛋白酶的活力分析58-63
• 3.4.1 菌株蛋白水解力的比較58-60
• 3.4.2 菌株蛋白酶活力60-61
• 3.4.3 乳蛋白降解SDS-PAGE分析61-63
• 3.5 促進(jìn)GDL酸化乳凝膠質(zhì)量蛋白酶乳酸菌的篩選63-68
• 3.5.1 GDL酸化曲線63-64
• 3.5.2 GDL濃度對(duì)乳凝膠強(qiáng)度的影響64
• 3.5.3 對(duì)乳凝膠質(zhì)量有促進(jìn)作用蛋白酶乳酸菌的篩選64-68
• 3.5.4 促進(jìn)凝乳蛋白酶菌株的選擇68
• 3.6 篩選菌株的鑒定68-70
• 3.6.1 篩選菌株形態(tài)學(xué)特性68-69
• 3.6.2 菌株鑒定69-70
• 3.7 本章小結(jié)70-71
• 第4章 乳酸菌蛋白酶的純化及性質(zhì)研究71-94
• 4.1 引言71-72
• 4.2 篩選菌株蛋白酶的提取純化72-86
• 4.2.1 粗酶液的濃縮72-73
• 4.2.2 陰離子交換層析參數(shù)優(yōu)化73-77
• 4.2.3 離子交換層析結(jié)果77-78
• 4.2.4 凝膠層析78-79
• 4.2.5 疏水層析參數(shù)優(yōu)化79-83
• 4.2.6 疏水層析結(jié)果83-86
• 4.3 酶學(xué)性質(zhì)研究86-92
• 4.3.1 酶動(dòng)力學(xué)參數(shù)測定86-87
• 4.3.2 最適反應(yīng)溫度87-88
• 4.3.3 熱變性溫度88-89
• 4.3.4 溫度穩(wěn)定范圍89
• 4.3.5 最適反應(yīng)p H89-90
• 4.3.6 p H穩(wěn)定范圍90-91
• 4.3.7 金屬離子對(duì)酶活力的影響91-92
• 4.4 本章小結(jié)92-94
• 第5章 乳酸菌蛋白酶影響凝乳品質(zhì)研究94-113
• 5.1 引言94
• 5.2 蛋白酶對(duì)凝膠蛋白水解度的影響94-96
• 5.3 各菌株蛋白酶組分對(duì)凝膠品質(zhì)的影響96-100
• 5.3.1 對(duì)凝膠質(zhì)構(gòu)的影響97-98
• 5.3.2 對(duì)凝膠表觀黏度的影響98-99
• 5.3.3 對(duì)凝膠脫水敏感性的影響99-100
• 5.4 蛋白酶對(duì)凝膠理化性質(zhì)的影響100-105
• 5.4.1 對(duì)凝膠粒徑分布的影響100-102
• 5.4.2 對(duì)凝膠zeta電位的影響102-103
• 5.4.3 蛋白酶對(duì)Ca~(2+)含量的影響103-105
• 5.5 蛋白酶對(duì)乳蛋白降解的影響105-106
• 5.6 蛋白酶對(duì)酪蛋白結(jié)構(gòu)的影響106-108
• 5.7 蛋白酶對(duì)乳凝膠流變性的影響108-111
• 5.8 本章小結(jié)111-113
• 結(jié)論113-115
• 參考文獻(xiàn)115-130
• 附錄 一130-131
• 附錄 二131-132
• 附錄 三132-140
• 附錄 四140-141
• 攻讀博士學(xué)位期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文141-143
• 致謝143-144
• 個(gè)人簡歷144

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本文編號(hào)：1083492