本文關(guān)鍵詞：pH-響應(yīng)納米藥物載體的設(shè)計與合成

  更多相關(guān)文章： pH-響應(yīng)性聚合物 藥物載體 基因載體 聚合物膠束 聚合物囊泡

【摘要】：pH-響應(yīng)性聚合物是一種能夠隨環(huán)境pH變化而產(chǎn)生物理性質(zhì)和化學(xué)性質(zhì)響應(yīng)的智能聚合物。結(jié)合最新的納米技術(shù),pH-響應(yīng)聚合物已被廣泛用于納米藥物載體的設(shè)計。利用正常組織和血液(pH 7.4)、腫瘤細胞外環(huán)境(pH 6.8)和細胞內(nèi)環(huán)境(pH 4.5-6.5)之間的pH差異,pH-響應(yīng)性藥物載體可以在特定部位釋放抗癌藥物或基因藥物,以提高治療效果和降低毒副作用。本論文基于pH-響應(yīng)性聚合物聚(p-氨基酯)(PBAE)、聚(二硫胺)(PSSA)、聚乙烯亞胺(PEI),構(gòu)建了四種載體,運送抗癌藥物或基因藥物：該載體含有對腫瘤細胞內(nèi)強還原環(huán)境敏感的二硫鍵或?qū)毎麅?nèi)涵體／溶酶體的低pH值具有響應(yīng)性的化學(xué)鍵(酯鍵、氨基甲酸酯鍵等),確保聚合物材料在響應(yīng)特殊環(huán)境時發(fā)生降解,有良好的生物相容性；可質(zhì)子化的伯氨基、仲胺基或叔氨基則在腫瘤細胞外酸性環(huán)境或細胞內(nèi)涵體／溶酶體的更低pH酸性環(huán)境,快速質(zhì)子化,改變載體性能(親水性、正電荷等),釋放負載基因或藥物。(1)自組裝制備靶向肝癌的聚合物膠柬藥物載體針對聚合物膠束藥物載體存在過早釋放藥物和缺少有效進入腫瘤機制的問題,利用非共價鍵作用力自組裝制備了靶向肝臟的聚合物膠束納米載體。合成了一系列含有高度疏水烷基碳鏈的聚乙二醇-co-聚(p-氨基酯)(MPEG-PBAE),能夠在水中自組裝形成負載阿霉素(DOX)的聚合物膠束。在高度稀釋的情況下聚合物膠束仍能夠保持穩(wěn)定性,并響應(yīng)pH 4.5的溶液環(huán)境快速釋放出DOX,沒有觀察到突釋現(xiàn)象。然后設(shè)計合成了兩親性的十二烷基-乳糖靶向配體(Gal-C12),通過疏水相互作用協(xié)同自組裝Gal-C12、MPEG-PBAE和DOX,制備負載DOX、表面修飾半乳糖殘基的聚合物膠束。細胞內(nèi)吞、體外細胞毒性和細胞周期分析等實驗結(jié)果表明通過無唾液酸糖蛋白受體介導(dǎo)的內(nèi)吞路徑,半乳糖官能團化的聚合物膠束能夠高效運送DOX進入HepG2細胞(肝癌細胞),在細胞內(nèi)釋放出負載DOX,顯著提高DOX的抑制腫瘤細胞增殖作用。該靶向肝臟藥物運送平臺具有方便靶向修飾、顯著提高藥物療效等優(yōu)點,非常有希望用于癌癥治療。(2) PEI-g-PSSA-g-PEI聚合物囊泡用作基因運送載體聚合物囊泡和脂質(zhì)體都有相似的中空囊泡結(jié)構(gòu)。脂質(zhì)體是研究最多的非病毒基因載體之一,脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine 2000已經(jīng)商品化。而聚合物囊泡用作基因載體的報道較少,應(yīng)用前景非常廣闊�，F(xiàn)有的聚合物囊泡所帶的正電荷密度非常低,不適合作基因載體。設(shè)計合成了一系列的陽離子兩親性聚合物PEI-g-PSSA-g-PEI,在水溶液中自組裝成陽離子聚合物囊泡。為了探討聚合物疏水性對轉(zhuǎn)染效率的影響,PEI-g-PSSA-g-PEI在統(tǒng)一的聚合反應(yīng)條件下合成,選用相同分子量的PEI片段作陽離子聚合物組分,通過改變PSSA主鏈疏水組分含量和使用不同疏水碳鏈長度的胺單體調(diào)控PEI-g-PSSA-g-PEI的疏水性。聚合物疏水組分含量分別為100%、80%、70%、60%,疏水胺單體分別有十二胺、十四胺、十六胺。聚合物疏水性與DNA親和力有關(guān)�；赑EI-g-PSSA-g-PEI的聚合物囊泡能自動包裹DNA形成復(fù)合物,平均粒徑小于200 nm, zeta電位為+10-+35 mV。體外細胞轉(zhuǎn)染實驗結(jié)果表明兩親性聚合物疏水／親水平衡是轉(zhuǎn)染效率的重要影響因素。對COS-7細胞轉(zhuǎn)染最高的是II-70%,疏水胺單體為十四胺,疏水組分含量為70%。與PEI 25k和Lipofectamine 2000相比,II-70%的轉(zhuǎn)染效率顯著提高,細胞毒性則明顯降低。研究結(jié)果表明具有可調(diào)控疏水性的陽離子聚合物囊泡是非常有潛力的非病毒基因載體。(3)硫特異性降解的聚乙烯亞胺類基因運送載體含有二硫鍵的交聯(lián)PEI衍生物是一類非常重要的陽離子聚合物基因載體,在血液和細胞外保持穩(wěn)定,進入細胞內(nèi)還原性環(huán)境后快速降解,能夠顯著提高轉(zhuǎn)染效率并降低聚合物的細胞毒性。文獻報道的含有二硫鍵的交聯(lián)PEI,在細胞內(nèi)還原性環(huán)境降解產(chǎn)生游離巰基,容易與細胞固有的巰基形成新的二硫鍵或破壞蛋白質(zhì)中的二硫鍵,擾亂細胞正常過程。為了解決這一問題,用二硫碳酸酯連接結(jié)構(gòu)(-NH-CO-O-CH2CH2SS。)將低分子量PEI (Mw:2 kDa)拼接成高分子量的PEI衍生物(PEI-SS-CL)。ESI-MS質(zhì)譜證實二硫碳酸酯連接結(jié)構(gòu)在細胞內(nèi)還原性環(huán)境中首先發(fā)生二硫鍵斷裂,然后巰基進攻相鄰的氨基甲酸酯連接鍵,將巰基轉(zhuǎn)化為五元環(huán)小分子化合物1,3-氧硫-2-環(huán)戊酮。PEI-SS-CL-1.5(交聯(lián)劑、PEI 2k摩爾比為1.5：1)能夠轉(zhuǎn)染COS-7、HepG2、Raw246.7等多種細胞,轉(zhuǎn)染效率明顯高于商品化轉(zhuǎn)染試劑PEI 25k和脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine 2000,細胞毒性則顯著降低。實驗結(jié)果表明在交聯(lián)PEI中引入硫特異性降解機制是設(shè)計安全、高效基因載體的有效策略。(4)異雙官能團交聯(lián)的PEI類基因運送載體為了開發(fā)出安全、高效的基因載體,研究者們通常使用同雙官能團交聯(lián)劑拼接低分子量PEI,得到可生物降解的高分子量PEI衍生物。由于反應(yīng)活性官能團沒有差異,極易暴聚得到不溶于水的高分子量聚合物。設(shè)計合成了含有氯甲酸酯和丙烯酸酯反應(yīng)活性基團的異雙官能交聯(lián)劑。由于氯甲酸酯與PEI的氨基反應(yīng)活性高于丙烯酸酯,PEI的氨基在-10℃優(yōu)先與氯甲酸酯反應(yīng),使得交聯(lián)劑一端偶聯(lián)到PEI上,當反應(yīng)溫度升至室溫后,丙烯酸酯與PEI的氨基進一步發(fā)生邁克爾加成反應(yīng),完成交聯(lián)反應(yīng)。因此,應(yīng)用該可控交聯(lián)策略有希望得到適當分子量、分子量分布窄的PEI衍生物。合成的交聯(lián)PEl分子量為原料PEI 2k的30-90倍,溶解度大于1 mg/mL。異官能團交聯(lián)PEI衍生物能高效包裹DNA形成復(fù)合物,平均粒徑100-200 nm, zeta電位+20一+35 mV。合成交聯(lián)PEI中,轉(zhuǎn)染效率最高的是PEI-HCL-1.5,交聯(lián)劑為含有氯甲酸酯、丙烯酸酯的1,4-丁二醇衍生物,交聯(lián)劑、PEI摩爾比為1.5：1。與PEI 25k和商品化脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine 2000相比,PEI-HCL-1.5的轉(zhuǎn)染效率顯著提高,細胞毒性較低。以上結(jié)果表明,使用異雙能團交聯(lián)劑交聯(lián)低分子量PEI,反應(yīng)易于控制,可以得到良好水溶性的適當分子量的PEI衍生物,能顯著提高轉(zhuǎn)染效率。
【關(guān)鍵詞】：pH-響應(yīng)性聚合物 藥物載體 基因載體 聚合物膠束 聚合物囊泡
【學(xué)位授予單位】：南京理工大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：TQ460.1;O631
【目錄】：

• 摘要5-8
• Abstract8-16
• 注釋表16-17
• 1 緒論17-42
• 1.1 兩親性聚合物構(gòu)建用于藥物和基因運送的pH-響應(yīng)載體19-25
• 1.1.1 pH-響應(yīng)聚合物膠束20-23
• 1.1.2 pH-響應(yīng)聚合物囊泡23-24
• 1.1.3 基于pH-響應(yīng)兩親性聚合物的藥物載體和基因載體面臨的問題及改進方法24-25
• 1.2 聚乙烯亞胺類基因載體25-28
• 1.2.1 水解PEI26-27
• 1.2.2 還原降解PEI27-28
• 1.2.3 聚乙烯亞胺類基因載體存在的問題及改進方法28
• 1.3 靶向腫瘤的聚合物載體28-30
• 1.4 本課題的研究目的和意義30-32
• 參考文獻32-42
• 2 自組裝制備靶向肝癌的聚合物膠束藥物載體42-69
• 2.1 引言42-44
• 2.2 實驗部分44-51
• 2.2.1 實驗材料44
• 2.2.2 實驗儀器44-45
• 2.2.3 無規(guī)共聚物MPEG-PBAE的合成45-46
• 2.2.4 合成靶向配體N-(1-脫氧乳糖基-1)-十二胺(Gal-C12)46-47
• 2.2.5 制備MPEG-PBAE膠束47
• 2.2.6 MPEG-PBAE膠束表征47
• 2.2.7 MPEG-PBAE膠束的pH-響應(yīng)性研究47-48
• 2.2.8 負載DOX·HCl和DOX體外釋放48-49
• 2.2.9 制備靶向肝癌細胞的負載DOX膠束49
• 2.2.10 細胞培養(yǎng)49-50
• 2.2.11 細胞內(nèi)藥物釋放和細胞內(nèi)吞50
• 2.2.12 體外細胞毒性50
• 2.2.13 細胞周期分析50-51
• 2.3 結(jié)果與討論51-63
• 2.3.1 合成兩親性聚合物MPEG-PBAE51-52
• 2.3.2 MPEG-PBAE膠束的制備和表征52-56
• 2.3.3 負載DOX和體外藥物釋放56-58
• 2.3.4 負載DOX的MPEG-PBAE的細胞內(nèi)藥物釋放58
• 2.3.5 負載DOX的MPEG-PBAE膠束的體外抗腫瘤研究58-59
• 2.3.6 自組裝制備靶向肝臟的負載DOX膠束59-60
• 2.3.7 DOX-MPEG-PBAE-C14-Gal的細胞內(nèi)吞研究60-61
• 2.3.8 DOX-MPEG-PBAE-C14-Gal的體外抗腫瘤效果61-62
• 2.3.9 細胞周期阻滯62-63
• 2.4 本章小結(jié)63-65
• 參考文獻65-69
• 3 PEI-g-PSSA-g-PEI聚合物囊泡基因運送載體69-92
• 3.1 前言69-71
• 3.2 實驗部分71-76
• 3.2.1 實驗材料71
• 3.2.2 實驗儀器71
• 3.2.3 合成二硫交聯(lián)劑N,N-二丙烯�；装�(CBA)71-72
• 3.2.4 合成PEI-g-PBAA-g-PEI72-73
• 3.2.5 制備聚合物囊泡73-74
• 3.2.6 聚合物囊泡結(jié)構(gòu)表征74
• 3.2.7 制備EGFP質(zhì)粒74-75
• 3.2.8 制備DNA復(fù)合物75
• 3.2.9 凝膠電泳實驗75
• 3.2.10 復(fù)合物的粒徑、電位實驗75
• 3.2.11 復(fù)合物的形貌表征75
• 3.2.12 細胞培養(yǎng)75-76
• 3.2.13 細胞轉(zhuǎn)染實驗76
• 3.2.14 流式細胞儀評價轉(zhuǎn)染效率76
• 3.2.15 細胞毒性實驗76
• 3.3 結(jié)果與討論76-86
• 3.3.1 合成接枝聚合物PEI-g-PSSA-g-PEI76-79
• 3.3.2 制備聚合物囊泡79-80
• 3.3.3 瓊脂糖凝膠電泳實驗80-82
• 3.3.4 復(fù)合物的粒徑和zeta電位實驗82
• 3.3.5 透射電鏡表征DNA復(fù)合物形貌82-83
• 3.3.6 細胞轉(zhuǎn)染實驗83-85
• 3.3.7 細胞毒性實驗85-86
• 3.4 本章小結(jié)86-87
• 參考文獻87-92
• 4 硫特異性降解的聚乙烯亞胺類基因運送載體92-115
• 4.1 前言92-94
• 4.2 實驗部分94-99
• 4.2.1 實驗材料94-95
• 4.2.2 實驗儀器95
• 4.2.3 合成含有碳酸酯和二硫連接鍵的PEI-SS-CLs95-97
• 4.2.4 制備EGFP質(zhì)粒97
• 4.2.5 制備DNA復(fù)合物97-98
• 4.2.6 凝膠電泳實驗98
• 4.2.7 復(fù)合物的粒徑、電位實驗98
• 4.2.8 PEI-SS-CLs的還原降解實驗98
• 4.2.9 DNA從復(fù)合物中解離實驗98
• 4.2.10 細胞培養(yǎng)98-99
• 4.2.11 細胞轉(zhuǎn)染實驗99
• 4.2.12 流式細胞儀評價轉(zhuǎn)染效率99
• 4.2.13 細胞毒性實驗99
• 4.3 結(jié)果與討論99-110
• 4.3.1 合成、表征PEI-SS-CLs99-101
• 4.3.2 瓊脂糖凝膠電泳實驗101-102
• 4.3.3 復(fù)合物的粒徑和zeta電位實驗102-103
• 4.3.4 PEI-SS-CLs還原降解實驗103-104
• 4.3.5 DNA從復(fù)合物解離實驗104-105
• 4.3.6 細胞轉(zhuǎn)染實驗105-108
• 4.3.7 細胞毒性試驗108-110
• 4.4 本章小結(jié)110-111
• 參考文獻111-115
• 5 異雙官能團交聯(lián)的PEI類基因運送載體115-133
• 5.1 前言115-116
• 5.2 實驗部分116-122
• 5.2.1 實驗材料116-117
• 5.2.2 實驗儀器117
• 5.2.3 交聯(lián)劑的合成117-119
• 5.2.4 合成異雙官能團交聯(lián)PEI衍生物119-120
• 5.2.5 制備EGFP質(zhì)粒120-121
• 5.2.6 制備DNA復(fù)合物121
• 5.2.7 凝膠電泳實驗121
• 5.2.8 復(fù)合物的粒徑、電位實驗121
• 5.2.9 細胞培養(yǎng)121
• 5.2.10 細胞轉(zhuǎn)染實驗121
• 5.2.11 流式細胞儀評價轉(zhuǎn)染效率121-122
• 5.2.12 細胞毒性實驗122
• 5.3 結(jié)果與討論122-129
• 5.3.1 合成、表征PEI-SS-CLs122-123
• 5.3.2 瓊脂糖凝膠電泳實驗123-124
• 5.3.3 復(fù)合物的粒徑和zeta電位實驗124-125
• 5.3.4 細胞轉(zhuǎn)染實驗125-128
• 5.3.5 細胞毒性實驗128-129
• 5.4 本章小結(jié)129-130
• 參考文獻130-133
• 6 結(jié)論133-137
• 6.1 主要結(jié)論133-135
• 6.2 本課題創(chuàng)新點135-136
• 6.3 研究展望136-137
• 致謝137-138
• 附錄A138-140
• 附錄B 部分產(chǎn)物的表征譜圖140-145

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