本文關鍵詞：柘樹果實抗氧化成分分析及其異黃酮Scandenolone誘導乳腺癌細胞凋亡通路研究

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【摘要】：目的：運用多種分離設備對柘果的抗氧化成分進行提取、分離、純化,核磁和液質(zhì)聯(lián)用設備進行結(jié)構(gòu)鑒定,得到柘果中的化合物。從細胞凋亡通路著手,分析異黃酮Scandenolone對乳腺癌細胞M231的抑制機理。通過一系列的研究,從而得到柘果的指紋圖譜,進一步得到柘果的藥用價值及其相應的作用機制。方法：(1)首先通過乙醇浸提柘樹果實,然后進行大孔樹脂和十八烷基硅烷鍵合硅膠(ODS)分離柱柱分離,最后運用制備液相設備得到柘樹果實中的抗氧化成分單體,用液質(zhì)聯(lián)用儀和核磁等手段進行單體結(jié)構(gòu)的確定。(2)MTT檢測異黃酮Scandenolone對M231細胞生長影響：原子力顯微鏡(atomic force microscopy, AFM)觀察異黃酮Scandenolone對M231細胞形態(tài)的影響；流式細胞術(shù)(flow cytometry, FCM)觀察異黃酮Scandenolone對M231細胞周期的影響；FCM觀察異黃酮Scandenolone對M231細胞線粒體膜電位(mitochondrial membrane potential, MMP)的影響；熒光酶標儀檢測異黃酮Scandenolone對M231細胞活性氧(reactie oxygen species, ROS)水平影響；Western blot測定異黃酮Scandenolone對M231細胞信號通路蛋白表達的影響,蛋白包括：casepase-3, PARP, Bcl-2, Bax, Bcl-xL, Bad, (p)-p53, (p)-JNK, (p)-ERK, (p)-AKT, (p)-p38, GADPHc結(jié)果：(1)經(jīng)過大孔樹脂柱分離后,得到4部分粗提物,分別是30%-乙醇粗提物(2.8g),50%-乙醇粗提物(4.0g),75%-乙醇粗提物(3.7g),95%-乙醇粗提物(0.3g)。將4部分粗提物進行抗氧化能力分析,發(fā)現(xiàn)75%-乙醇部分抗氧化能力最強,進一步分離純化得到13個單體,其中4個已經(jīng)得到其具體結(jié)構(gòu),分別為：Arctiin, erythrivarone A, 2-(3,4-dimethoxybenzyl)-3-(3-methoxy-4-hydroxybenzyl)-c-butyrolactone, lappaol F。(2) Scandenolone可明顯的抑制乳腺癌細胞M231的生長,當用20ug/mL濃度的Scandenolone作用細胞72h后,細胞幾乎完全停止生長,選定3個濃度(10,12.5,15ug/ml)進行后續(xù)實驗；AFM結(jié)果,Scandenolone作用細胞24h后,發(fā)現(xiàn)隨濃度的增大,細胞形狀逐漸從菱形變?yōu)閳A形,且細胞體積逐漸縮小,并從壁上脫落。FCM結(jié)果,引起Sub-G1凋亡峰百分數(shù)急劇增加,由低濃度組(10ug/ml)的17.9%上升到高濃度組(15ug/ml)的99.3%,同對照組比所有作用濃度均有統(tǒng)計學差異(P0.05),而在Scandenolone作用下,G0/G1,S和G2/M峰沒受多大影響,且隨著藥物濃度的增加,線粒體膜電位下降。熒光酶標儀檢測結(jié)果,隨著藥物濃度增加,ROS含量會升高,當處理時間為30mmin時,ROS含量上升到最大,隨后趨于穩(wěn)定。western blot結(jié)果,不同濃度Scandenoloneon作用M231細胞24 h后,各刺激組casepase-3表達量降低,并且給藥組同對照組相比都具有統(tǒng)計學意義(P0.05), PARP表達量也明顯降低,給藥組同對照組比都具有統(tǒng)計學意義(P0.001)；隨著Scandenolone劑量的增加,在總的p53蛋白水平變化不大(P0.05),而p53的磷酸化增加,給藥組同同對照組比都具有統(tǒng)計學意義(P0.001)：上調(diào)Bax和Bcl-2的表達,但是Bax/Bcl-2的比值隨著Scandenolone的濃度增加而呈劑量效應的下降(P0.001),而對Bad、Bcl-xl蛋白的表達無顯著影響；隨著Scandenoloneon劑量的增加,在總的p38 MAPKs蛋白水平保持不變的情況下(P0.05),而p38 MAPKs的磷酸化水平隨劑量的增加而增加,給藥組同同對照組比具有統(tǒng)計學意義(P0.01),除低劑量組(0.5ug/ml)例外。而AKT, ERK, JNK三個激酶磷酸化水平基本沒變。結(jié)論：(1)得到4個化合物的結(jié)構(gòu),它們是Arctiin, erythrivarone A, 2-(3,4-dimethoxybenzyl)-3-(3-methoxy-4-hydroxybenzyl)-c-butyrolactone, lappaol F。(2) Scandenolone具有抗乳腺癌活性,其凋亡通路為：Scandenolone刺激細胞的ROS含量增高,引起細胞的氧化損傷,進而抑制AKT、ERK口JNK的磷酸化,導致p38和p53的活化,線粒體膜電位降低和Bcl-2家族的表達改變,最終激活凋亡執(zhí)行蛋白casepase-3,引發(fā)M231細胞發(fā)生凋亡。
【關鍵詞】：柘樹果實 分離 提取 結(jié)構(gòu)鑒定 Scandenolone MMP ROS 細胞凋亡通路 M231
【學位授予單位】：四川農(nóng)業(yè)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：TS201.4
【目錄】：

• 摘要4-6
• ABSTRACT6-8
• 縮略詞8-11
• 1 前言11-17
• 1.1 柘樹研究現(xiàn)狀11-15
• 1.1.1 化學成分研究11-12
• 1.1.2 活性成分藥理研究12-15
• 1.2 柘樹果實研究現(xiàn)狀15-16
• 1.3 乳腺癌概述16
• 1.4 本研究的目的和意義16-17
• 1.5 研究內(nèi)容17
• 2 材料與方法17-30
• 2.1 實驗材料17-21
• 2.1.1 實驗材料17
• 2.1.2 主要儀器17-18
• 2.1.3 主要試劑18-21
• 2.2 實驗方法21-30
• 2.2.1 柘果抗氧化成分的提取與分離21-26
• 2.2.2 異黃酮SCANDENOLONE對乳腺癌細胞M231作用機制研究26-30
• 3 結(jié)果與討論30-59
• 3.1 柘果抗氧化成分的分離、提取、純化及結(jié)構(gòu)鑒定30-49
• 3.1.1 抗氧化部分確定30-32
• 3.1.2 化合物結(jié)構(gòu)解析32-48
• 3.1.3 本節(jié)小結(jié)48-49
• 3.2 異黃酮SCANDENOLONE對乳腺癌細胞M231作用機制研究49-59
• 3.2.1 異黃酮Scandenolone對乳腺癌細胞M231生長抑制作用和試驗條件49-50
• 3.2.2 FCM觀察異黃酮SCANDENOLONE對M231細胞周期的影響結(jié)果50-51
• 3.2.3 FCM觀察異黃酮SCANDENOLONE對M231細胞線粒體膜電位影響結(jié)果51-52
• 3.2.4 酶標儀觀察異黃酮SCANDENOLONE對M231細胞ROS影響結(jié)果52-53
• 3.2.5 WESTERN BLOT測定SCANDENOLONEON對M231細胞凋亡通路的判斷53-58
• 3.2.6 本節(jié)小結(jié)58-59
• 4 結(jié)論與展望59-61
• 4.1 研究結(jié)論59
• 4.1.1 柘果的抗氧化成分的分離、提取、純化及結(jié)構(gòu)鑒定59
• 4.1.2 異黃酮SCANDENOLONE對乳腺癌細胞M231作用機制研究59
• 4.2 論文的創(chuàng)新點59-60
• 4.3 展望60-61
• 參考文獻61-66
• 致謝66-67
• 攻讀學位期間發(fā)表的學術(shù)論文目錄67

【相似文獻】

中國碩士學位論文全文數(shù)據(jù)庫 前1條

1 曹春廷;柘樹果實抗氧化成分分析及其異黃酮Scandenolone誘導乳腺癌細胞凋亡通路研究[D];四川農(nóng)業(yè)大學;2015年

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本文編號：1114992