多氯聯(lián)苯降解菌的篩選及其降解性能研究

發(fā)布時間：2020-07-25 10:06

【摘要】： 多氯聯(lián)苯(Polychlorinated biphenyls,PCBs)是一類典型的、分布廣泛的持久性有機氯代污染物,其組成復雜,理論上有209種同類物和異構體。近20年來,生物降解PCBs的研究一直是環(huán)境科學技術領域的熱點,獲得能夠降解不同種類PCB同類物的高效好氧降解菌株是其中需要解決的關鍵問題。本論文首先以相似物為底物從變壓器油污染點篩選獲得了一株降解PCBs的新菌株,經(jīng)分子生物學鑒定和生理生化指標鑒定,確認該菌株為腸桿菌屬(Enterobacter sp.),命名為LY402。進一步以Aroclor系列的PCBs混合物為研究對象,系統(tǒng)研究了該菌株對不同PCB同類物的降解能力及其影響因素;采用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術對其中間代謝產(chǎn)物進行了鑒定;利用同源分析進行引物設計,通過PCR等方法對LY402中的PCB降解酶基因進行了全面解析,獲得了如下研究結果: (1)Enterobacter sp.LY402休眠細胞在30℃對濃度為2mg/L的Aroclor1242、1254、1260的降解率分別能夠達到87.3%、60%和29.1%。LY402能夠降解高濃度的PCBs,LY402對100mg/LAroclor1242的6天降解率能夠達到60%,說明該菌株具有很強的抗污染物毒性的能力。 (2)Enterobacter sp.LY402對3mg/L的Aroclor系列(1242:1254:1260=1:1:1)混合物生物降解動力學研究表明,在無外加碳源的無機鹽液體培養(yǎng)基中,經(jīng)過6天降解,91個色譜峰中的51個消失,23個色譜峰的峰面積有不同程度的降低,10余個色譜峰的峰面積未見明顯變化,75%Aroclor系列混合物被有效降解。 (3)不同PCB同類物的生物降解速率相差很大,氯取代數(shù)量和取代位點是影響生物降解速率的主要因素。在氯取代數(shù)量影響PCB同類物生物降解率的考察中發(fā)現(xiàn),2-5個氯取代的所有PCB同類物均能被LY402快速有效降解;95%的6氯代PCB異構體能夠被有效降解;75%的7氯代PCB異構體能夠被降解,其降解效果雖不如6氯代的PCB異構體高,但仍很明顯;8氯、9氯取代的PCB同類物幾乎未被降解。LY402對PCBs的降解總體上遵循隨著氯取代數(shù)量的增多,生物降解速率降低的規(guī)律。研究發(fā)現(xiàn),氯取代位點對PCB同類物和異構體的生物降解率有很大影響。Enterobacter sp.LY402既能降解鄰位氯取代的PCBs,也能降解對位氯取代的PCBs,但對位氯取代(4,4＇和3,3＇,4,4＇)對生物降解具有明顯的抑制作用。在112個PCB同類物中,有13個未被有效降解,其中的12個含有3,3＇,4,4＇氯取代位點,包括具有共平面或類共平面結構的高毒性PCBs。與已經(jīng)報道的PCBs高效降解菌株相比,Enterobacter sp.LY402的PCBs降解效果總體上優(yōu)于其它菌株。 (4)Enterobacter sp.LY402降解PCBs代謝產(chǎn)物的研究表明,LY402在降解PCBs的過程中會產(chǎn)生不同取代位點的氯代苯甲酸,發(fā)現(xiàn)在降解過程中存在顯著的好氧脫氯現(xiàn)象。同時證實LY402對PCBs的代謝產(chǎn)物氯代苯甲酸也有一定的降解作用,可以部分降解單氯代氯苯甲酸,但對兩個氯以上取代的氯代苯甲酸降解效果不明顯。 (5)對Enterobacter sp.LY402降解PCBs的系列降解酶基因(biphenyl-catabolic gene,bph)進行了解析。發(fā)現(xiàn)在LY402的細胞中含有一個約20Kb的質(zhì)粒,PCB降解相關基因均位于質(zhì)粒上。根據(jù)降解基因的同源性設計引物、通過PCR擴增并對產(chǎn)物測序,獲得了LY402中bph基因簇的幾乎全部基因序列(10.65Kb),通過序列比較分析發(fā)現(xiàn),LY402的bph基因簇與已發(fā)表的PCB高效降解菌株Pseudomonas sp.LB400的相關序列高度同源,只在聯(lián)苯雙加氧酶的小亞基發(fā)生了一個堿基的突變(C~(70)→T),該堿基突變導致一個氨基酸的變化(Thr~(24)→Ile)。但LB400中的bph基因簇是處于1400Kb的巨型質(zhì)粒上,由于兩個菌株的種屬親緣性相差較遠,對于二者PCB降解基因上的高親緣性目前還缺乏準確的解釋。 (6)表面活性劑作為降解菌LY402的碳源能夠明顯促進PCBs的生物降解。在相同條件下,在以2g/L的生物表面活性劑月桂酸蔗糖酯和非離子表面活性劑Tween-80為碳源的生長細胞體系中,LY402對4mg/L Aroclor1242的12小時降解率分別達到75.4%和64.7%,比相同情況下的以聯(lián)苯為碳源的降解體系降解率分別高出20.6%和9.9%。研究了月桂酸蔗糖酯對不同組成Aroclor系列PCBs生物降解率的影響。在2g/L月桂酸蔗糖酯生長細胞體系中,LY402對2 mg/L的Aroclor1242、1254、1260的生物降解率分別為98.5%、79.9%和64.5%,比相同情況下的休眠細胞體系分別提高了12.2%、19.9%和35.5%,尤其使6氯、7氯等高氯取代PCB同類物的生物降解率得到了顯著提高。上述研究結果表明,Enterobacter sp.LY402是迄今發(fā)現(xiàn)的好氧降解效率最高、降解PCB同類物的種類最廣的降解菌之一,對PCBs生物降解動力學和降解機理的研究使我們對微生物的降解能力有了更深入的認識,為進一步基因改造菌株、提高PCBs污染點的生物強化修復效率提供了依據(jù)。
【學位授予單位】：大連理工大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2008
【分類號】：X703
【圖文】：

雙加氧酶,六聚體,聯(lián)苯,氯代苯甲酸

共代謝產(chǎn)物氯代苯甲酸，除LB400對2-氯代苯甲酸和2，3一氯代苯甲酸株不能將其進一步礦化，需要與其它可降解氯代苯甲酸的細菌協(xié)同作化。大多數(shù)氯代苯甲酸是通過氯代兒茶酚途徑被降解的[40](如圖1氧菌共代謝PCBs的相關降解酶研究CBs好氧生物降解能力影響最大的是降解途徑中的第一個酶，即聯(lián)。聯(lián)苯雙加氧酶屬于形eske型非血紅素鐵N心(H)P依賴型加氧亞基組成，分別是鐵硫蛋白(IsP)a大亞基(BphAI)、鐵硫蛋白、負責電子傳遞的鐵氧還蛋白(BphA3)和鐵氧還蛋白還原酶(p亞基對底物的識別、結合和選擇性非常重要。如雖然LB400和相差20個氨基酸，但兩者的底物范圍卻相差很大，特別是335，(按照KF707雙加氧酶編號)對酶的選擇性最為重要147]。

鐵離子,單核,底物,氯代苯甲酸