本文關(guān)鍵詞： 聚唾液酸 大腸桿菌 培養(yǎng)方式 代謝特性 提取 中試　出處：《江南大學(xué)》2011年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：聚唾液酸(Polysialic acid)是唾液酸以α-2, 8和(或)α-2, 9糖苷鍵連接而成的同聚物。聚唾液酸具備良好的生物相容性、非免疫原性和可降解性,是理想的藥物緩釋和醫(yī)用支架材料。此外,聚唾液酸經(jīng)降解或者酶催化可得到一系列的唾液酸類衍生物,這些衍生物多為應(yīng)用于醫(yī)藥或食品和保健品領(lǐng)域的高附加值產(chǎn)品。 微生物發(fā)酵法是目前獲得聚唾液酸的唯一途徑,本研究采用的菌株是大腸桿菌CCTCC M208088 (Escherichia coli CCTCC M208088)。本論文旨在通過對聚唾液酸制備過程中的發(fā)酵和提純工藝進(jìn)行優(yōu)化,實(shí)現(xiàn)聚唾液酸的高效生產(chǎn)。首先,從E. coli CCTCC M208088合成聚唾液酸的培養(yǎng)條件、培養(yǎng)方式、代謝特性、生理脅迫、釋放效率等多個(gè)角度出發(fā),實(shí)施一系列以強(qiáng)化聚唾液酸合成為目的發(fā)酵調(diào)控策略;其次,基于聚唾液酸發(fā)酵液的特性,構(gòu)建出一條完整的提取純化工藝。本論文主要研究內(nèi)容總結(jié)如下: (1)對E. coli CCTCC M208088合成聚唾液酸的培養(yǎng)條件(pH和溶氧調(diào)控方式)進(jìn)行了優(yōu)化。經(jīng)過pH調(diào)控策略的優(yōu)化,確定了氨水流加控制pH的策略,結(jié)果聚唾液酸產(chǎn)量大幅提高了58%,達(dá)到3.03 g/L。與此同時(shí),殘留磷酸鹽濃度從19.31 g/L左右降到1.72 g/L,大大減輕了后續(xù)產(chǎn)物提純和廢水處理的難度。在此基礎(chǔ)上,進(jìn)一步考察了攪拌速率和溶氧濃度對聚唾液酸發(fā)酵的影響,發(fā)現(xiàn)較高的溶氧條件有利于聚唾液酸的合成。通過對不同攪拌速率發(fā)酵結(jié)果的比較發(fā)現(xiàn):在500-700 r/min范圍內(nèi),低攪拌速率利于菌體的生長,而高攪拌速率有利于產(chǎn)物的合成。于是引入了分階段調(diào)控策略,在發(fā)酵前期(12 h之前)采用低攪拌速率500 r/min,保證菌體的最適生長狀態(tài),而在發(fā)酵中期開始(12 h之后)采取高攪拌速率700 r/min,結(jié)果聚唾液酸產(chǎn)量進(jìn)一步提高至3.92 g/L。 (2)對E. coli CCTCC M208088合成聚唾液酸的培養(yǎng)方式進(jìn)行了優(yōu)化。考察了分批培養(yǎng)和分批補(bǔ)料培養(yǎng)模式(間歇式流加、恒速流加、變速流加、指數(shù)速率流加)對聚唾液酸發(fā)酵的影響。結(jié)果表明,分批培養(yǎng)有利于聚唾液酸的合成,而分批補(bǔ)料培養(yǎng)有利于菌體的生長。為了整合兩種發(fā)酵方式的優(yōu)勢,提出分批補(bǔ)料-分批培養(yǎng)組合發(fā)酵策略:發(fā)酵前期采用分批補(bǔ)料的方式(指數(shù)速率流加)使菌體濃度迅速增加,當(dāng)菌體濃度接近最高水平時(shí)(16 h),一次性補(bǔ)入高濃度山梨醇轉(zhuǎn)入分批發(fā)酵階段,結(jié)果聚唾液酸產(chǎn)量達(dá)到了5.70 g/L。 (3)研究了添加丙酮酸對E. coli CCTCC M208088代謝網(wǎng)絡(luò)碳流通量分布的影響。發(fā)現(xiàn)添加丙酮酸可以顯著加強(qiáng)三羧酸循環(huán),提高菌體細(xì)胞的產(chǎn)能效率,同時(shí)一定程度上減弱磷酸戊糖途徑的碳流通量,弱化菌體生長與產(chǎn)物合成對共用資源的競爭,從而提升了聚唾液酸的合成效率。在此基礎(chǔ)上,將丙酮酸添加與組合發(fā)酵策略結(jié)合起來,聚唾液酸產(chǎn)量提高至6.92 g/L。 (4)利用生理脅迫和促釋放策略強(qiáng)化E. coli CCTCC M208088合成聚唾液酸的效率。考察了不同表面活性劑處理對聚唾液酸釋放和合成的影響,發(fā)現(xiàn)吐溫-60可以在促進(jìn)聚唾液酸釋放的同時(shí)強(qiáng)化聚唾液酸的合成效率。與對照相比,12 h添加0.4 g/L吐溫-60可提高聚唾液酸產(chǎn)量10.9%。此外,考察了雙氧水脅迫策略對聚唾液酸合成的影響,結(jié)果發(fā)現(xiàn)在發(fā)酵過程中4 h添加7.5 mmol/L,8 h添加15 mmol/L,12 h添加15 mmol/L,16 h添加25 mmol/L H2O2的四點(diǎn)添加策略可使聚唾液酸產(chǎn)量比非脅迫情況下提高19.8%。 (5)為了構(gòu)建聚唾液酸的提取工藝,對聚唾液酸的穩(wěn)定性、分離特性以及發(fā)酵液中主要雜質(zhì)的去除方法進(jìn)行了研究。首先,確定了聚唾液酸保持結(jié)構(gòu)穩(wěn)定的條件:熱處理不超過100℃、酸堿處理在pH 5-10范圍內(nèi)。在此基礎(chǔ)上,優(yōu)化了氯代十六烷基吡啶(CPC)絡(luò)合沉淀聚唾液酸的反應(yīng)條件:CPC質(zhì)量濃度為聚唾液酸3倍,NaCl0.1 mol/L,pH 6.0-7.0,溫度40℃。此外,確定了乙醇沉淀聚唾液酸的適宜條件,即處理液中添加氯化鈉至0.68 mol/L,然后加入3倍體積的乙醇。最后,研究了珍珠巖過濾除雜的適宜的操作條件:處理液pH=10,珍珠巖用量為80 g/L。 (6)確立了提取和精制聚唾液酸的工藝。為了提取聚唾液酸,發(fā)酵液首先經(jīng)過80℃加熱預(yù)處理30 min,然后離心去除菌體,得到的上清液用乙醇沉淀,沉淀物用水復(fù)溶后,以珍珠巖為助濾劑進(jìn)行過濾,濾液經(jīng)過超濾脫鹽后再用CPC絡(luò)合沉淀,形成的CPC-PSA絡(luò)合沉淀物轉(zhuǎn)移至0.8 mol/L NaCl溶液中復(fù)溶解離,然后再次利用乙醇沉淀,沉淀物洗滌后真空干燥即得聚唾液酸。得到的聚唾液酸樣品純度可達(dá)95%,總回收率在50-60%之間。為了制備醫(yī)藥級別的產(chǎn)品,聚唾液酸提取樣品需要進(jìn)一步的精制。樣品依次經(jīng)過超濾、離子交換和凝膠過濾層析處理,再經(jīng)脫鹽、濃縮、冷凍干燥,得到最終產(chǎn)品。產(chǎn)品中蛋白未檢出,內(nèi)毒素含量低于100 EU/mg,純度達(dá)到99.9%。精制樣品的紅外和核磁共振圖譜的特征吸收峰與文獻(xiàn)報(bào)道的α-2, 8糖苷鍵連接聚唾液酸比對一致。 (7)優(yōu)化的聚唾液酸生產(chǎn)工藝進(jìn)行了500 L規(guī)模的中試放大驗(yàn)證,聚唾液酸產(chǎn)量達(dá)到5.50 g/L,分離得到的聚唾液酸純度達(dá)到95%。中試的產(chǎn)量、發(fā)酵生產(chǎn)強(qiáng)度以及生產(chǎn)規(guī)模均為目前報(bào)道的最高水平。
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【學(xué)位授予單位】：江南大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2011
【分類號】：Q50

【引證文獻(xiàn)】

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本文編號：1489867