本文關(guān)鍵詞：RNA干擾α-突觸核蛋白基因表達(dá)對(duì)甲基苯丙胺中毒大鼠神經(jīng)毒性的影響及差異蛋白質(zhì)的篩選和鑒定

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【摘要】：研究背景： 甲基苯丙胺(Methamphetamine, METH)是一種新型毒品,屬于苯丙胺類神經(jīng)興奮劑(Amphetamine-Typed Stimulant, ATS),其鹽酸鹽為透明的結(jié)晶體,外觀狀如冰,俗稱“冰毒”。因具有見(jiàn)效快、興奮作用維持時(shí)間長(zhǎng)、價(jià)格低廉、化學(xué)合成技術(shù)簡(jiǎn)單、多途徑攝取等特點(diǎn),METH的濫用及蔓延速度極快,成為當(dāng)今我國(guó)危害最為嚴(yán)重和濫用的兩大毒品之一。METH的濫用不僅給個(gè)人生理及心理帶來(lái)極大痛苦,更給家庭和社會(huì)帶來(lái)沉重負(fù)擔(dān)。因此,對(duì)METH神經(jīng)毒性損傷的機(jī)制及其防治手段的研究已成為世界面臨的重大課題和研究熱點(diǎn)。 METH為擬交感胺類興奮劑,具有中樞神經(jīng)興奮性、致幻、食欲抑制和擬交感神經(jīng)能效應(yīng)等藥理、毒理學(xué)特性。大量臨床資料表明,METH可引起體內(nèi)重要實(shí)質(zhì)器官的損害,包括心、腦、肺、肝、腎等,但更主要的是對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)的毒性。METH濫用能引起明顯的行為和精神改變,導(dǎo)致大腦黑質(zhì)、紋狀體、海馬皮質(zhì)多部位損傷,可致動(dòng)物大腦多巴胺能及五羥色胺能末梢損傷,包括紋狀體內(nèi)多巴胺(DA)含量下降,多巴胺轉(zhuǎn)運(yùn)體(DAT)降低,酪氨酸羥化酶(TH)活性減少,5-HT及代謝產(chǎn)物的耗竭,單胺囊泡轉(zhuǎn)運(yùn)體2(VMAT-2)及多巴胺攝取位點(diǎn)缺失,導(dǎo)致神經(jīng)元、軸索損傷,神經(jīng)細(xì)胞凋亡。 目前,關(guān)于METH的神經(jīng)毒性機(jī)制尚未完全明確�，F(xiàn)階段的研究結(jié)果顯示多種機(jī)制和途徑參與了METH的神經(jīng)毒性。這些機(jī)制主要包括：①過(guò)量多巴胺的氧化作用及氧化應(yīng)激損傷；②谷氨酸的興奮性作用所致的Ca2+超載和細(xì)胞穩(wěn)態(tài)破壞；③線粒體損傷和功能障礙；④激活多條凋亡相關(guān)通路、誘發(fā)神經(jīng)元凋亡等。其中氧化應(yīng)激是METH所致神經(jīng)毒性損傷的重要作用機(jī)制。 在我們前一階段的研究中,對(duì)METH注射后大鼠紋狀體、皮質(zhì)、海馬等部位的差異表達(dá)蛋白質(zhì)進(jìn)行了鑒定,認(rèn)為氧化應(yīng)激、能量代謝障礙、蛋白酶體功能失調(diào)及凋亡等是METH神經(jīng)毒性的主要機(jī)制。同時(shí)也發(fā)現(xiàn)METH大鼠模型紋狀體區(qū)活性氧(ROS)、一氧化氮合酶(NOS)和過(guò)氧亞硝酸鹽(ONOO)、NO和脂質(zhì)過(guò)氧化產(chǎn)物丙二醛(MDA)明顯增加,超氧化物歧化酶(SOD)含量下降,伴有神經(jīng)元凋亡,發(fā)現(xiàn)二甲基精氨酸二甲基氨基水解酶(DDAH)表達(dá)增高,提出DDAH/ADMA/NOS系統(tǒng)可能是NO過(guò)表達(dá)引起的中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷病理過(guò)程的重要調(diào)控機(jī)制。在上述研究中,我們首次發(fā)現(xiàn)METH大鼠模型組紋狀體、皮質(zhì)、海馬三個(gè)腦區(qū)中a-突觸核蛋白(a-synuclein, a-syn)表達(dá)明顯升高。 α-突觸核蛋白由140個(gè)氨基酸構(gòu)成的酸性可溶性蛋白,主要分布于神經(jīng)元的核膜及突觸前末梢。a-syn參與正常突觸功能的維持,在調(diào)節(jié)突觸可塑性和遞質(zhì)釋放等方面有重要的作用；可以與許多信號(hào)蛋白、骨架蛋白、酶和離子等結(jié)合,有伴侶分子樣活性的作用。a-syn基因敲除小鼠卻未發(fā)現(xiàn)有明顯功能損害和形態(tài)改變,表明其生理功能具有代償機(jī)制。a-syn高濃度或過(guò)表達(dá)時(shí)又對(duì)神經(jīng)元有細(xì)胞毒的效應(yīng)。在高濃度時(shí),a-syn形成細(xì)胞毒性更大的p-折疊寡聚物,這預(yù)示著該蛋白質(zhì)的異常聚集和纖維化與帕金森病(PD)、阿爾茨海默病(AD)等神經(jīng)退行性疾病密切相關(guān)。METH可導(dǎo)致大腦出現(xiàn)與上述神經(jīng)退行性病變相類似的改變,并且METH使用者患PD的比率明顯升高。最近的研究顯示METH可以導(dǎo)致小鼠黑質(zhì)紋狀體區(qū)產(chǎn)生類似Lewys小體的包涵體。在PD等許多神經(jīng)退行性疾病中,多巴胺遞質(zhì)釋放減少、氧化應(yīng)激、Ca2+超載、線粒體功能損傷和細(xì)胞凋亡等幾種損傷機(jī)制密切相關(guān)、協(xié)同作用,而a-syn在其中扮演著重要的角色。當(dāng)其濃度升高時(shí)既參與了神經(jīng)損傷的啟動(dòng),同時(shí)也變成損傷過(guò)程的效應(yīng)蛋白,促進(jìn)神經(jīng)元變性直至死亡。a-syn的硝基化促進(jìn)了其寡聚體的穩(wěn)定性導(dǎo)致其毒性持續(xù)增強(qiáng),因此,它有可能是METH神經(jīng)毒性損傷中的靶蛋白。正如前面所述,METH所致神經(jīng)損傷也包含上述幾種損傷機(jī)制,而a-syn在皮質(zhì)、海馬和紋狀體表達(dá)升高,這預(yù)示著a-syn與上述損傷機(jī)制之間也存在著必然的聯(lián)系,作為重要的靶蛋白參與了神經(jīng)損傷的過(guò)程。 本課題組前一階段通過(guò)RNAi技術(shù)沉默人多巴胺能神經(jīng)細(xì)胞系SH-SY5Y細(xì)胞中a-syn基因,發(fā)現(xiàn)干擾a-syn表達(dá)可抑制METH引起的細(xì)胞活力下降、TH、 DAT、VMAT-2等基因水平下降、多巴胺耗竭和ROS、NOS、NO水平升高,能抵抗METH引起的線粒體△Ψm下降、MPTP開(kāi)放、細(xì)胞外鈣離子內(nèi)流,抑制線粒體的細(xì)胞色素C釋放進(jìn)入胞漿,從而在一定程度上保護(hù)線粒體的正常功能、抵抗METH引起的細(xì)胞死亡。但這一結(jié)果尚未在體內(nèi)得到驗(yàn)證,且a-syn究竟是通過(guò)何種路徑參與METH的神經(jīng)毒性損傷、其調(diào)控的靶蛋白究竟有哪些及其可能的機(jī)制尚未見(jiàn)報(bào)道,也正是本研究的目的。 目前,RNA干擾(RNAi)技術(shù)已成為研究基因功能的主要工具,與傳統(tǒng)的基因抑制相比,RNAi技術(shù)具有更強(qiáng)大、更持久地抑制基因表達(dá)的能力,其效能是反義寡核苷酸的100-10000倍,并且具有高度的序列特異性,無(wú)免疫原性,能克服蛋白抑制劑應(yīng)用中所存在的不足。iTRAQ (isobaric tags for relative and absolute quantitation)技術(shù)是一種多肽體外標(biāo)記技術(shù)。該技術(shù)采用4種或8種同位素的標(biāo)簽,通過(guò)特異性標(biāo)記多肽的氨基基團(tuán),進(jìn)行串聯(lián)質(zhì)譜分析,可同時(shí)比較4種或8種不同樣品中蛋白質(zhì)的相對(duì)含量或絕對(duì)含量。iTRAQ技術(shù)靈敏度高,樣品需求量少,相對(duì)于傳統(tǒng)技術(shù)能夠篩選出更多的差異蛋白。 因此,本研究擬利用RNAi技術(shù)在體內(nèi)抑制a-syn的表達(dá),為研究a-syn在METH介導(dǎo)的神經(jīng)毒性損傷中的機(jī)制提供載體；并應(yīng)用iTRAQ技術(shù)篩選差異蛋白并進(jìn)行定性和定量分析,探討這些蛋白和METH神經(jīng)毒性之間的聯(lián)系。 目的： 建立a-syn沉默大鼠模型,運(yùn)用行為學(xué)、酶化學(xué)等方法,全面了解a-syn抑制后對(duì)METH導(dǎo)致的多巴胺系統(tǒng)和氧化應(yīng)激系統(tǒng)損傷的影響；在此基礎(chǔ)上,利用iTRAQ技術(shù),篩選和鑒定出給予METH刺激及RNA干擾a-syn后,大鼠紋狀體的差異表達(dá)蛋白質(zhì),結(jié)合已知蛋白質(zhì)的功能,探討a-syn在METH神經(jīng)毒性機(jī)制中的作用。 方法： 1.RNA干擾a-syn大鼠模型的建立 成年雄性Wistar大鼠,隨機(jī)分成4組,①對(duì)照組(control, CON);②模型組(model, model);③陰性病毒組(empty vector);④陽(yáng)性病毒組(RNAi):使用本課題組前期合成并鑒定有效的a-syn-ShRNA重組病毒。利用腦立體定向注射技術(shù)向大鼠紋狀體注射相應(yīng)的物質(zhì),CON組和model組均注射生理鹽水,empty vector組注射陰性病毒,RNAi組注射a-syn-ShRNA重組病毒。注射后二周,取各組大鼠紋狀體檢測(cè)a-syn的表達(dá),實(shí)時(shí)熒光定量PCR、Western Blot分別檢測(cè)a-syn在基因和蛋白水平的表達(dá)變化。 2.RNA干擾a-syn對(duì)METH毒性損傷的影響 利用成功建立的a-syn沉默大鼠模型,給予METH刺激,CON組腹腔注射生理鹽水,model組、empty vector組和RNAi組動(dòng)物腹腔注射METH,劑量15mg/kg,每天早8：00點(diǎn)、晚6：00點(diǎn)各注射一次,連續(xù)注射4天,共8次。觀察動(dòng)物的行為變化,體重、進(jìn)食量、飲水量的變化；酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)方法(ELISA)檢測(cè)各組大鼠紋狀體多巴胺(DA)和絡(luò)氨酸羥化酶(TH)的含量；TUNEL法檢測(cè)細(xì)胞凋亡；酶化學(xué)方法檢測(cè)ROS、NOS、NO的活性變化,分別用ROS熒光檢測(cè)試劑盒、NOS活性檢測(cè)試劑盒、NOS檢測(cè)試劑盒檢測(cè)。 3.RNA干擾a-syn與METH神經(jīng)毒性相關(guān)差異蛋白質(zhì)的篩選和鑒定 每組取6個(gè)紋狀體組織,取適量紋狀體組織,加入SDT裂解液,勻漿均勻后超聲裂解：離心取上清,利用BCA法進(jìn)行蛋白質(zhì)濃度測(cè)定。各取20μg蛋白質(zhì)樣品進(jìn)行SDS-PAGE電泳、考馬斯亮藍(lán)染色檢測(cè)蛋白質(zhì)量。各組取400μg樣品進(jìn)行酶解和肽段定量。分別取約64gg酶解后的肽段,用iTRAQ Reagent-4plexMultiplex Kit進(jìn)行肽段標(biāo)記后,采用納升流速HPLC液相系統(tǒng)Easy nLC進(jìn)行分離,用Q-Exactive質(zhì)譜儀進(jìn)行肽段的定性和定量分析。 結(jié)果： 1.RNA干擾a-syn大鼠模型成功建立。α-syn-shRNA重組慢病毒成功轉(zhuǎn)染至大鼠紋狀體細(xì)胞,可抑制a-syn基因mRNA表達(dá)達(dá)到80%,Western Blot實(shí)驗(yàn)也證實(shí)RNAi組大鼠紋狀體內(nèi)α-syn蛋白表達(dá)顯著下降。 2.METH注射后動(dòng)物進(jìn)食量明顯減少(P0.001),具有明顯的食欲抑制作用,并可導(dǎo)致動(dòng)物體重下降(P0.001)；METH導(dǎo)致動(dòng)物出現(xiàn)明顯的行為學(xué)改變,主要表現(xiàn)為好動(dòng)、易激惹等,動(dòng)物刻板行為評(píng)分明顯高于對(duì)照組(P0.001)。METH促進(jìn)動(dòng)物活動(dòng)量增加,從而導(dǎo)致動(dòng)物口渴口干,飲水量上升；RNAi組動(dòng)物與model組比較,上述異常表現(xiàn)均有所減少(P0.001)。 3. METH注射后動(dòng)物紋狀體內(nèi)DA含量和TH活性均明顯下降,RNAi組動(dòng)物與model組比較,DA含量和TH活性均顯著上升(P0.001)。 4. METH注射后動(dòng)物紋狀體內(nèi)ROS上升,RNAi組動(dòng)物與model組比較,ROS含量顯著下降(P0.001)。 5. METH注射后動(dòng)物紋狀體內(nèi)NOS活性和NO含量均明顯下降,RNAi組動(dòng)物與model組比較,NOS活性和NO含量均顯著上升(P0.001)。 6.利用iTRAQ技術(shù)鑒定到的蛋白質(zhì)組2327個(gè),其中65個(gè)蛋白同時(shí)在RNAi組和empty vector組以及model組CON組存在差異。這65個(gè)蛋白質(zhì)中,包括9個(gè)細(xì)胞骨架蛋白、5個(gè)突觸功能相關(guān)蛋白、5個(gè)細(xì)胞增殖和凋亡相關(guān)蛋白、3個(gè)泛素相關(guān)蛋白、2個(gè)核糖體蛋白和涉及神經(jīng)遞質(zhì)、線粒體功能、能量代謝等功能的蛋白。 結(jié)論： 1.成功建立RNA干擾a-syn大鼠模型,在基因和蛋白水平都證實(shí)了a-syn表達(dá)量的下降。 2.干擾a-syn表達(dá)可抑制METH中毒大鼠動(dòng)物行為學(xué)上異常表現(xiàn)；通過(guò)提高TH的活性從而提高DA的含量,緩解METH導(dǎo)致的多巴胺系統(tǒng)的紊亂；直接抑制ROS的含量,通過(guò)降低NOS活性從而降低NO的含量,緩解METH導(dǎo)致的氧化應(yīng)激和硝化應(yīng)激的損傷。 3.蛋白質(zhì)精氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶5可能是a-突觸核蛋白參與METH神經(jīng)毒性的效應(yīng)蛋白,通過(guò)上調(diào)蛋白質(zhì)精氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶5活性而增加NO生成,增強(qiáng)氧化應(yīng)激損傷；a-突觸核蛋白通過(guò)調(diào)節(jié)泛素羧基端水解酶24和VCIP135的表達(dá)參與了泛素-蛋白酶體系統(tǒng)的調(diào)控。 4.在甲基苯丙胺的神經(jīng)毒性作用中,α-突觸核蛋白扮演了重要角色,參與了氧化應(yīng)激、凋亡、細(xì)胞骨架損傷和神經(jīng)遞質(zhì)障礙等神經(jīng)損傷過(guò)程。
【關(guān)鍵詞】：甲基苯丙胺(METH) α-突觸核蛋白 RNA干擾 氧化應(yīng)激 多巴胺 泛素-蛋白 酶體通路 線粒體
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號(hào)】：D919.1
【目錄】：

• 摘要3-9
• ABSTRACT9-17
• 前言17-33
• 參考文獻(xiàn)26-33
• 第一章 RNA干擾α-突觸核蛋白大鼠模型的建立33-57
• 1 材料與方法33-47
• 2 結(jié)果47-51
• 3 討論51-54
• 4 參考文獻(xiàn)54-57
• 第二章 RNA干擾α-突觸核蛋白對(duì)METH毒性損傷的影響57-91
• 1 材料與方法57-65
• 2 結(jié)果65-83
• 3 討論83-87
• 4 參考文獻(xiàn)87-91
• 第三章 RNA干擾α-突觸核蛋白與METH神經(jīng)毒性相關(guān)差異蛋白質(zhì)的篩選和鑒定91-122
• 1 材料與方法91-99
• 2 結(jié)果99-110
• 3 討論110-118
• 4 參考文獻(xiàn)118-122
• 全文小結(jié)122-124
• 英文縮略詞注釋124-125
• 攻讀博士學(xué)位期間成果125-126
• 致謝126-129
• 統(tǒng)計(jì)學(xué)證明129

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