發(fā)布時(shí)間：2017-09-19 19:10

  本文關(guān)鍵詞：3,4-亞甲基二氧基甲基苯丙胺對(duì)大鼠心肌細(xì)胞Connexin43以及細(xì)胞內(nèi)鈣穩(wěn)態(tài)的影響

  更多相關(guān)文章： 3 4-亞甲基二氧基甲基苯丙胺 心電檢測(cè) 連接蛋白43 鈣振蕩 磷酸化 法醫(yī)毒理學(xué)

【摘要】：【研究背景】 搖頭丸，其主要成分為3,4-亞甲基二氧基甲基苯丙胺（MDMA），常見(jiàn)于夜總會(huì)、迪吧、歌廳以及各種狂歡聚會(huì)場(chǎng)合，使用者多為22歲左右的年輕人。國(guó)內(nèi)外研究及臨床數(shù)據(jù)證實(shí)MDMA除了神經(jīng)毒性之外，還具有肝毒性和心血管毒性。MDMA急性中毒可導(dǎo)致顯著的心血管功能異常，表現(xiàn)為心率增加，血壓增高以及心肌耗氧量增加引起高血壓、心律失常、心肌缺血甚至心衰。已知的研究數(shù)據(jù)表明，MDMA可通過(guò)神經(jīng)遞質(zhì)途徑產(chǎn)生間接的心血管毒性作用，而其氧化代謝產(chǎn)物可破壞細(xì)胞抗氧化防御系統(tǒng)誘導(dǎo)氧化應(yīng)激從而引起心肌細(xì)胞損傷。雖然大量的證據(jù)表明MDMA能夠?qū)е滦墓δ墚惓＃瞧鋵?duì)于心肌細(xì)胞的直接毒性作用的機(jī)制卻尚未探明，MDMA是否還具有其它的心肌毒性作用仍然是未知領(lǐng)域。 心肌縫隙連接已經(jīng)被廣泛證實(shí)在維持心肌的正常搏動(dòng)節(jié)律中起到至關(guān)重要的作用。它能夠保持心肌細(xì)胞間搏動(dòng)電傳導(dǎo)的致性和穩(wěn)定性�？p隙連接蛋白的異常，包括蛋白含量，分布以及磷酸化狀態(tài)的改變，都可導(dǎo)致致死性心律失常的發(fā)生。然而，到目前為止，尚未有研究針對(duì)MDMA誘發(fā)心律失常與心室肌細(xì)胞縫隙連接蛋白之間的關(guān)聯(lián)�；谇捌诘睦碚摵蛯�(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)，我們?cè)诒菊n題中針對(duì)MDMA與心肌細(xì)胞縫隙連接蛋白的影響進(jìn)行深入的研究，從而進(jìn)步揭示MDMA直接誘導(dǎo)心肌毒性的分子毒理機(jī)制。 【目的】 1.觀察MDMA急性中毒對(duì)大鼠心電功能的影響； 2.觀察MDMA急性中毒對(duì)大鼠心肌細(xì)胞縫隙連接蛋白43的影響； 3.體外原代培養(yǎng)新生大鼠心室肌細(xì)胞并構(gòu)建體外MDMA急性染毒模型，觀察不同濃度MDMA急性染毒對(duì)于心室肌細(xì)胞CX43蛋白表達(dá)含量以及轉(zhuǎn)錄水平的影響； 4.觀察不同濃度MDMA急性染毒對(duì)于體外培養(yǎng)新生大鼠心室肌細(xì)胞間連接蛋白43含量以及分布的影響； 5.觀察不同濃度的MDMA急性染毒對(duì)體外培養(yǎng)新生大鼠心室肌細(xì)胞連接蛋白43磷酸化位點(diǎn)Ser368磷酸化狀態(tài)的影響； 6.觀察MDMA急性染毒對(duì)于體外培養(yǎng)心室肌細(xì)胞內(nèi)鈣振蕩模式以及細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度的影響。 【實(shí)驗(yàn)方法】 1.將搖頭丸片劑研磨、溶解，對(duì)獲得的溶液進(jìn)行酸-堿反提萃取法提取MDMA有效成分，并運(yùn)用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用系統(tǒng)對(duì)提取物進(jìn)行成分以及純度檢驗(yàn)； 2.動(dòng)物實(shí)驗(yàn)：將18只SPF級(jí)SD大鼠隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組。實(shí)驗(yàn)組大鼠腹腔注射20mg/kg MDMA后實(shí)時(shí)記錄其心電圖以及心率變化。對(duì)照組則給予腹腔注射無(wú)菌生理鹽水后記錄其心電圖以及心率變化。所有大鼠在24小時(shí)后采用頸椎脫臼法處死，迅速剪取心室部分并用生理鹽水沖洗干凈，多聚甲醛固定、石蠟包埋并制作切片。利用HE染色觀察心肌細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化。利用免疫組織化學(xué)法對(duì)心室肌細(xì)胞中連接蛋白43進(jìn)行定量分析，并觀察其分布情況。 3.體外實(shí)驗(yàn)：選取0天或1天SPF級(jí)新生大鼠，消毒后迅速剪取心臟心室部分，利用混合組織消化液分步消化結(jié)合差速貼壁法獲得純化的心室肌細(xì)胞，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。于培養(yǎng)第6天，加入含有10、100、1000μM濃度的MDMA的無(wú)血清培養(yǎng)基進(jìn)行急性染毒1小時(shí)，，建立MDMA急性染毒體外模型。提取心室肌細(xì)胞總膜蛋白，利用蛋白免疫印跡法檢測(cè)心室肌細(xì)胞中總連接蛋白43的表達(dá)含量的變化。同時(shí)提取細(xì)胞總RNA，利用熒光實(shí)時(shí)定量PCR法檢測(cè)連接蛋白43mRNA（GJA1）表達(dá)含量的變化。 4.利用免疫熒光法檢測(cè)不同濃度（10、100、1000μM）的MDMA染毒的心室肌細(xì)胞縫隙連接處連接蛋白43的表達(dá)和分布改變。 5.向體外培養(yǎng)的心室肌細(xì)胞中加入1000μM MDMA急性染毒1小時(shí)后，提取實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組心室肌細(xì)胞總蛋白，利用Western Blot法檢測(cè)連接蛋白43磷酸化位點(diǎn)Ser368的磷酸化狀態(tài)的改變，并檢測(cè)心室肌細(xì)胞中PKC的含量。利用Fluo-4標(biāo)記鈣離子，在激光共聚焦顯微鏡下觀察MDMA急性染毒組和對(duì)照組新生大鼠心室肌細(xì)胞內(nèi)鈣振蕩模式的變化以及細(xì)胞內(nèi)鈣濃度的改變。 【數(shù)據(jù)分析】所有結(jié)果采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差。組間比較采用雙向方差分析法，兩組比較采用非配對(duì)t檢驗(yàn)法，p值小于0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。所有統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS13.0軟件以及Graph prism醫(yī)學(xué)統(tǒng)計(jì)軟件。 【結(jié)果】 1.從搖頭丸中提取的MDMA成分經(jīng)質(zhì)譜檢驗(yàn)未見(jiàn)其它活性雜質(zhì)，MDMA純度高達(dá)95%。 2.心電圖結(jié)果顯示急性MDMA腹腔注射后大鼠出現(xiàn)明顯的心電圖異常，表現(xiàn)為QRS間期延長(zhǎng)，波幅增強(qiáng)，并呈現(xiàn)不規(guī)則變化。實(shí)時(shí)心率檢測(cè)顯示，實(shí)驗(yàn)組大鼠心率發(fā)生顯著改變，大鼠心率變化起伏不定，并表現(xiàn)為不規(guī)則波動(dòng)。實(shí)驗(yàn)組大鼠平均心率呈下降趨勢(shì)。 3.實(shí)驗(yàn)組大鼠心室肌細(xì)胞未見(jiàn)明顯形態(tài)學(xué)改變，部分視野下可見(jiàn)心肌纖維萎縮，橫紋消失，肌漿呈嗜酸性變性，散在局灶性空泡樣變性。 4.實(shí)驗(yàn)組大鼠中有2只大鼠在注射MDMA后2小時(shí)內(nèi)發(fā)生自發(fā)性死亡。免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)組大鼠心肌細(xì)胞連接蛋白43表達(dá)含量顯著下降。自發(fā)性死亡大鼠心肌細(xì)胞可見(jiàn)連接蛋白43分布異常，沿心肌細(xì)胞兩側(cè)長(zhǎng)軸方向分布。 5.體外培養(yǎng)的新生大鼠心室肌細(xì)胞可見(jiàn)成片搏動(dòng)。MDMA急性染毒組心肌細(xì)胞總連接蛋白43含量以及連接蛋白43mRNA表達(dá)均顯著下降。免疫熒光檢測(cè)見(jiàn)100、1000μM高濃度MDMA染毒可引起縫隙連接中連接蛋白43的含量下降及分布異常。MDMA還引起心肌細(xì)胞N-鈣粘蛋白的表達(dá)顯著下降。 6.高濃度MDMA可導(dǎo)致連接蛋白43磷酸化狀態(tài)改變，表現(xiàn)為非磷酸化狀態(tài)比例上升，同時(shí)可引起磷酸化位點(diǎn)Ser368的磷酸化水平增加，但卻對(duì)心肌細(xì)胞內(nèi)PKC含量未造成影響。高濃度MDMA同時(shí)還引起心肌細(xì)胞內(nèi)鈣振蕩模式的改變和鈣離子濃度的上升。 【結(jié)論】 1.動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證實(shí)MDMA可誘發(fā)大鼠心率改變以及心電異常，甚至猝死，這些毒性作用與其引起心肌細(xì)胞連接蛋白43表達(dá)含量下降有關(guān)。 2.體外實(shí)驗(yàn)表明MDMA可直接作用于心室肌細(xì)胞引起連接蛋白43基因轉(zhuǎn)錄水平以及蛋白表達(dá)顯著下降，同時(shí)其引起心肌N-鈣粘蛋白水平的下調(diào)與MDMA導(dǎo)致連接蛋白43的分布異常有關(guān)。 3. MDMA可誘發(fā)心室肌細(xì)胞內(nèi)鈣振蕩模式的改變以及細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度的增加介導(dǎo)相應(yīng)蛋白激酶的活性引起連接蛋白43磷酸化磷酸化位點(diǎn)Ser368磷酸化水平升高。 4.本研究首次證實(shí)了MDMA可破壞心肌細(xì)胞內(nèi)鈣穩(wěn)態(tài)，影響心肌細(xì)胞連接蛋白43的表達(dá)、分布以及磷酸化狀態(tài)，誘發(fā)心電功能障礙，從而導(dǎo)致心律失常的發(fā)生。這也是MDMA直接心肌毒性的潛在作用機(jī)制之。
【關(guān)鍵詞】：3 4-亞甲基二氧基甲基苯丙胺 心電檢測(cè) 連接蛋白43 鈣振蕩 磷酸化 法醫(yī)毒理學(xué)
【學(xué)位授予單位】：華中科技大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號(hào)】：D919.1
【目錄】：

• 主要縮略語(yǔ)英漢對(duì)照6-9
• 引言9-17
• 參考文獻(xiàn)13-17
• 中文摘要17-21
• ABSTRACT21-26
• 實(shí)驗(yàn)研究 Ⅰ26-44
• 前言26-27
• 1. 材料和方法27-30
• 2. 結(jié)果30-37
• 3. 討論37-40
• 4. 結(jié)論40-41
• 5. 參考文獻(xiàn)41-43
• 附圖43-44
• 實(shí)驗(yàn)研究 Ⅱ44-73
• 前言44-46
• 1. 材料和方法46-52
• 2. 結(jié)果52-57
• 3. 討論57-60
• 4. 結(jié)論60-61
• 5. 參考文獻(xiàn)61-67
• 附圖67-73
• 實(shí)驗(yàn)研究 Ⅲ73-122
• 前言73-75
• 1. 材料和方法75-99
• 2. 結(jié)果99-109
• 3. 討論109-114
• 4. 結(jié)論114-115
• 5. 參考文獻(xiàn)115-122
• 實(shí)驗(yàn)研究 Ⅳ122-140
• 前言122-124
• 1. 材料和方法124-129
• 2. 結(jié)果129-133
• 3. 討論133-135
• 4. 參考文獻(xiàn)135-140
• 課題小結(jié)140-141
• 創(chuàng)新點(diǎn)141
• 研究展望141-142
• 綜述142-155
• 參考文獻(xiàn)150-155
• 附錄155-160
• 致謝160-161

【參考文獻(xiàn)】

中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前10條

1 鄭少攀,盧延旭;苯丙胺類興奮劑的法醫(yī)毒理學(xué)研究進(jìn)展[J];中國(guó)法醫(yī)學(xué)雜志;2004年01期

2 王虹,王軍,劉桂紅;“搖頭丸”中主要成分檢驗(yàn)[J];公安大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版);2003年01期

3 葉青;成云飛;張祥民;;搖頭丸中氯胺酮和咖啡因的現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)[J];化學(xué)研究與應(yīng)用;2011年07期

4 馮雪芳;呂劍杰;張鐵營(yíng);虞建鋒;;苯丙胺類興奮劑急性中毒65例臨床分析[J];實(shí)用醫(yī)學(xué)雜志;2010年18期

5 吳國(guó)萍;相秉仁;;近紅外光譜技術(shù)應(yīng)用于搖頭丸中MDMA、MA無(wú)損定量分析的研究[J];分析測(cè)試學(xué)報(bào);2007年05期

6 趙傮,曹家琪,劉志民,連智;MDMA研究進(jìn)展[J];中國(guó)藥物依賴性雜志;2002年03期

7 邱澤武,孫成文,藍(lán)紅,張少華,吳小航;苯丙胺類興奮劑急性中毒12例臨床分析[J];中華內(nèi)科雜志;2002年11期

8 劉志民,周偉華,連智,穆悅,呂憲祥,曹家琪,滕英群;“搖頭丸”濫用情況調(diào)查[J];中國(guó)心理衛(wèi)生雜志;2000年05期

9 劉鐵橋,郝偉,王小平,賀捷靈,李合群,熊鵬,范長(zhǎng)河,唐衛(wèi)東,陳珊梅;苯丙胺類興奮劑(ATS)娛樂(lè)性使用情況及其人群特征[J];中國(guó)心理衛(wèi)生雜志;2002年05期

10 孫毅,徐本樹(shù),王志強(qiáng),金俊,呂秋霖,張惠民;250例苯丙胺類搖頭丸(MDMA)濫用人群分析[J];中國(guó)藥物濫用防治雜志;2004年05期

本文編號(hào)：883399