發(fā)布時(shí)間：2017-09-08 16:13

  本文關(guān)鍵詞：束縛應(yīng)激對擠壓傷大鼠肝損害的影響及其內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激機(jī)制

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【摘要】：目的：在實(shí)際檢案中經(jīng)常遇到當(dāng)事人遭受非致命性機(jī)械性損傷后發(fā)生MODS甚至死亡的案件，例如打架斗毆、交通事故、虐待以及刑訊逼供等。由于損傷本身不足以致人死亡，因此常常由于死亡原因不能確定或有爭議，導(dǎo)致案件久拖不決，給社會造成不良影響。此外，在臨床實(shí)踐中也經(jīng)常發(fā)生非致命傷患者在治療期間病情逐漸加重或者死亡的情況，醫(yī)療糾紛時(shí)有發(fā)生，醫(yī)患關(guān)系緊張。因此揭示非致命性機(jī)械性損傷的死亡機(jī)制是危重病醫(yī)學(xué)和法醫(yī)學(xué)亟待解決的問題。 此類損傷對機(jī)體的損害主要包括三方面：①局部組織損傷，產(chǎn)生大量活性自由基進(jìn)而引起脂質(zhì)過氧化、細(xì)胞內(nèi)鈣離子超載及嗜中性粒細(xì)胞的浸潤并釋放大量炎癥因子，以及壞死組織吸收、產(chǎn)生代謝產(chǎn)物，導(dǎo)致遠(yuǎn)隔器官損傷及全身炎癥反應(yīng)等；②損傷本身作為一種軀體應(yīng)激原，可引起機(jī)體應(yīng)激反應(yīng)；③當(dāng)事人在損傷后產(chǎn)生的緊張、疼痛、抑郁等情緒，以及合法權(quán)益得不到維護(hù)而產(chǎn)生的不良情緒也可作為心理應(yīng)激原引起機(jī)體應(yīng)激反應(yīng)。因此，此類損傷對機(jī)體造成的損害是由損傷和應(yīng)激共同參與的。應(yīng)激時(shí)機(jī)體的全身反應(yīng)主要表現(xiàn)為藍(lán)斑-交感-腎上腺髓質(zhì)系統(tǒng)(Locusceruleus-norepinephrine system, LC/NE)和下丘腦-垂體-腎上腺皮質(zhì)軸(Hypothalamus-pituitary-adrenal cortex system, HPA)的激活，使血液中兒茶酚胺和糖皮質(zhì)激素（在大鼠主要為皮質(zhì)酮）迅速升高，具有重要的代償防御意義。但應(yīng)激原過于強(qiáng)烈或持久時(shí)，機(jī)體的各種反應(yīng)雖仍具有某些防御適應(yīng)意義，但其主要作用則轉(zhuǎn)變?yōu)閷?dǎo)致機(jī)體功能障礙、代謝紊亂和組織損傷。目前應(yīng)激造成組織損傷的機(jī)制尚不明確。 大量研究證實(shí)，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(Endoplasmic reticulum stress, ERS)是應(yīng)激時(shí)主要的細(xì)胞反應(yīng)。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是細(xì)胞合成、加工蛋白質(zhì)及貯存Ca2+的主要細(xì)胞器。應(yīng)激激素、氧自由基和細(xì)胞因子等都可以干擾內(nèi)質(zhì)網(wǎng)功能，導(dǎo)致未/錯誤折疊蛋白堆積，ERS標(biāo)志蛋白如GRP78等表達(dá)增加，激活ERS。ERS雖是細(xì)胞防御適應(yīng)反應(yīng)的重要組成部分，但過于強(qiáng)烈或持續(xù)時(shí)間過長的ERS可通過誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡和炎癥反應(yīng)造成組織、細(xì)胞損傷。因此研究ERS對組織器官的損傷作用對于揭示非致命性機(jī)械損傷導(dǎo)致死亡的機(jī)制具有重要意義。 肝臟具有合成、生物轉(zhuǎn)化及免疫等多種功能，肝功能障礙可出現(xiàn)出血、繼發(fā)感染、腎功能障礙甚至肝性腦病等臨床綜合征。肝細(xì)胞代謝功能活躍，含有大量的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，而內(nèi)質(zhì)網(wǎng)對蛋白代謝和應(yīng)激信號的傳導(dǎo)具有十分重要的作用，因此應(yīng)激發(fā)生時(shí)肝臟可能是最易受累的器官之一。大量研究表明，ERS可能是多種肝損傷發(fā)生的重要因素之一，且本室前期研究證明，束縛應(yīng)激可加重?cái)D壓傷大鼠肝臟損傷，但機(jī)制是否與ERS有關(guān)尚不清楚。 擠壓傷模型是公認(rèn)的復(fù)制廣泛性軟組織機(jī)械性損傷的動物模型，束縛應(yīng)激是公認(rèn)的研究心理精神應(yīng)激的動物模型。因此為模擬實(shí)際案情，本實(shí)驗(yàn)以建立大鼠擠壓傷和束縛應(yīng)激的復(fù)合模型為基礎(chǔ)，研究ERS在肝損傷中的作用機(jī)制，為揭示非致命性機(jī)械性損傷導(dǎo)致死亡的機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 方法：健康雄性Sprague Dawley(SD)大鼠36只，體重200~220g，于控制條件下適應(yīng)性喂養(yǎng)一周后，隨機(jī)分為六組。①正常組：大鼠常規(guī)條件喂養(yǎng)，不給予任何刺激，作為空白對照。②禁食水組：大鼠于每天固定時(shí)間(08:30㧟16:30)禁食水，其余時(shí)間自由進(jìn)食水，自由活動，連續(xù)7天。③束縛應(yīng)激組：每天將大鼠于固定時(shí)間(08:30㧟16:30)放入束縛應(yīng)激模具內(nèi)8小時(shí)，禁食水，其余時(shí)間可自由活動及進(jìn)食水，連續(xù)束縛7天。④擠壓組：大鼠用無水乙醚麻醉后，于雙后肢上壓24kg重物，連續(xù)擠壓6小時(shí)。⑤復(fù)合模型組：每天于固定時(shí)間(08:30㧟16:30)將大鼠放入束縛應(yīng)激模具內(nèi)8小時(shí)，連續(xù)7天，于次日無水乙醚麻醉后，雙后肢上壓24kg重物連續(xù)擠壓6小時(shí)。⑥ERS抑制劑組：大鼠在每日束縛應(yīng)激或擠壓前半小時(shí)給予10mg/mL4-苯基丁酸(4-phenylbutyric acid,4-PBA)1.5mL腹腔注射。正常組、禁食水組和束縛應(yīng)激組分別于造模結(jié)束后即刻取大鼠肝臟組織；擠壓組、復(fù)合模型組及ERS抑制劑組分別于造模結(jié)束后3天取大鼠肝臟組織，一部分經(jīng)固定制作石蠟切片，一部分經(jīng)液氮速凍后㧟80℃冰箱保存。石蠟切片進(jìn)行蘇木精-伊紅(HE)染色觀察肝組織病理學(xué)改變及應(yīng)用免疫組織化學(xué)染色(IHC)方法觀察大鼠肝組織中ERS標(biāo)志蛋白GRP78和CHOP蛋白表達(dá)的變化。㧟80℃冰箱保存的肝組織經(jīng)勻漿提取蛋白后應(yīng)用Western印跡法檢測大鼠肝組織ERS標(biāo)志蛋白GRP78和CHOP以及凋亡執(zhí)行分子Caspase3蛋白表達(dá)的變化并應(yīng)用酶聯(lián)免疫吸附分析法(ELISA)檢測肝組織炎癥因子IL-1的表達(dá)量改變。 數(shù)據(jù)以“均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(Mean±SD)”表示，用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，各組均數(shù)的比較行單因素方差分析(ANOVA)，用最小顯著差法(least significant difference, LSD)作兩兩比較，以P0.05為有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。 結(jié)果： 1肝臟HE染色結(jié)果 正常組肝組織結(jié)構(gòu)清晰，肝細(xì)胞大小一致、以中央靜脈為中心呈索狀整齊排列；禁食水組可見血管周圍有少量炎細(xì)胞浸潤；束縛應(yīng)激組可見肝細(xì)胞輕度水腫和少量炎細(xì)胞浸潤；擠壓傷組可見肝細(xì)胞水腫和炎細(xì)胞浸潤；與擠壓傷組相較，復(fù)合模型組大鼠肝臟組織損傷更加嚴(yán)重，可見肝索排列紊亂，炎細(xì)胞浸潤、肝細(xì)胞水腫、肝細(xì)胞脂肪變性及肝細(xì)胞壞死，部分肝細(xì)胞發(fā)生氣球樣變；ERS抑制劑組可見肝細(xì)胞水腫及炎細(xì)胞浸潤，但大鼠肝臟組織病理學(xué)變化較復(fù)合模型組減輕。 2肝組織ERS標(biāo)志蛋白GRP78和CHOP免疫組織化學(xué)染色(IHC)結(jié)果 光鏡下，免疫陽性細(xì)胞胞漿呈棕黃色、細(xì)胞核呈淡藍(lán)色；部分陽性細(xì)胞發(fā)生細(xì)胞凋亡的形態(tài)學(xué)改變：細(xì)胞皺縮，細(xì)胞核碎裂、溶解。 正常組大鼠肝組織GRP78和CHOP蛋白有少量陽性表達(dá)；禁食水組大鼠肝組織GRP78和CHOP蛋白有少量陽性表達(dá)，位于細(xì)胞漿內(nèi)，呈棕色。束縛組大鼠肝組織GRP78和CHOP蛋白表達(dá)增多。擠壓傷組大鼠肝組織GRP78和CHOP蛋白表達(dá)進(jìn)一步增多；與擠壓組相比，，復(fù)合模型組陽性細(xì)胞數(shù)目明顯增多且陽性表達(dá)明顯增強(qiáng)；與復(fù)合模型組相比，ERS抑制劑組陽性細(xì)胞數(shù)目減少并且陽性表達(dá)減弱。 3肝組織ERS標(biāo)志蛋白GRP78和CHOP以及凋亡執(zhí)行分子Caspase3的Western印跡檢測結(jié)果 正常組和禁食水組GRP78、CHOP和Caspase3蛋白有少量表達(dá)；束縛組大鼠肝組織GRP78、CHOP,和Caspase3蛋白表達(dá)量增多；擠壓傷組大鼠肝組織GRP78、CHOP和Caspase3蛋白表達(dá)進(jìn)一步增多；與擠壓組相比復(fù)合模型組大鼠肝組織GRP78、CHOPh和Caspase3蛋白表達(dá)均明顯增多，p＜0.05；ERS抑制劑組，大鼠肝組織GRP78、CHOP和Caspase3蛋白表達(dá)量較復(fù)合模型組明顯降低，p＜0.05。 4肝組織炎癥因子IL-1檢測結(jié)果 正常組和禁食水組炎癥因子IL-1有少量表達(dá)；束縛組大鼠肝組織IL-1表達(dá)增多；擠壓傷組大鼠肝組織IL-1表達(dá)進(jìn)一步增多；與擠壓傷組相比復(fù)合模型組大鼠肝組織IL-1表達(dá)明顯增多，p＜0.05；ERS抑制劑組大鼠肝組織炎癥因子IL-1表達(dá)量較復(fù)合模型組明顯降低，p＜0.05。 結(jié)論： 本研究成功建立了大鼠束縛應(yīng)激和擠壓傷及其復(fù)合模型，通過檢測ERS標(biāo)志蛋白GRP78、ERS誘導(dǎo)凋亡的關(guān)鍵分子CHOP、凋亡執(zhí)行者Caspase3以及炎癥因子IL-1的表達(dá)水平，得出以下結(jié)論： 束縛應(yīng)激可以加重?cái)D壓傷所致的大鼠肝臟損傷，其機(jī)制與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡和炎癥反應(yīng)有關(guān)。
【關(guān)鍵詞】：應(yīng)激 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激 肝臟 束縛 擠壓 4-苯基丁酸
【學(xué)位授予單位】：河北醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號】：D919.1
【目錄】：

• 摘要4-8
• ABSTRACT8-13
• 英文縮寫13-15
• 前言15-16
• 材料與方法16-28
• 結(jié)果28-31
• 附圖31-38
• 附表38-39
• 討論39-44
• 結(jié)論44-45
• 參考文獻(xiàn)45-50
• 綜述 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激與肝損害50-65
• 參考文獻(xiàn)59-65
• 致謝65-66
• 個人簡歷66

【參考文獻(xiàn)】

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中國碩士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫 前1條

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本文編號：814999