本文關鍵詞：基于PDP-MCA的MVP分型技術及其在斑痕鑒別中的應用

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【摘要】：【目的】本研究旨在探索新型法醫(yī)分子斑痕標記及其檢測技術。首先建立一種簡便快速的基因組甲基化可變位點(Methylationvariableposition,MVP)分析技術--快速甲基化敏感性限制酶消化后PCR鏈融解曲線法(postfast-methylationsensitiverestrictionenzymedigestionPCRmeltingcurveanalysis,PDP-MCA)，然后用該技術調(diào)查一組織特異性MVP在法醫(yī)學常見斑痕中的甲基化狀態(tài)，評價其作為斑痕標記的可行性。 【方法】PDP-MCA技術的建立與評價：以文獻報道的差異甲基化區(qū)(differentiallymethylatedregion,DMR)為模型，在MVP位點兩側設計一組產(chǎn)物Tm值各不相同的引物。在同一反應管內(nèi)，順次進行基因組DNA的FastdigestMSRE酶切、復合擴增和鏈溶解曲線分析，Rotor-Gene2.0.2.4軟件分析數(shù)據(jù)生成MCA圖譜，Origin8軟件進行峰參數(shù)計算和統(tǒng)計分析，根據(jù)各片段融鏈峰的面積和峰高比例判斷相應MVP位點的甲基化水平。同時用PDP-MCA和傳統(tǒng)的MSRE-PCR技術檢測相同的樣品，驗證方法的可行性。組織特異性MVP作為法醫(yī)斑痕標記的可行性：用上述PDP-MCA技術調(diào)查法醫(yī)學常見斑痕(血斑、唾液斑、精斑各20份，月經(jīng)血斑、陰道液斑各12份)MVP位點的甲基化狀態(tài)，分析比較不同斑痕的MCA/HRM圖譜，提取每個片段解鏈前后的標準熒光變化值，，用StatistiXL軟件對樣本數(shù)據(jù)進行判別分析，初步確立各種斑痕的判別方程。 【結果】(1)Tm值相差2℃以上的4個片段，復合擴增、復合MCA分析可以生成分離良好的融鏈峰，鏈融解曲線法可以代替電泳實現(xiàn)快速閉管檢測。利用甲基化敏感性的FastDigest內(nèi)切酶，可以在同一反應管內(nèi)實現(xiàn)快速酶切、擴增和MCA檢測，不同細胞有不同的MCA圖譜。與對照管相比較，組成酶切管MCA圖譜的各MVP峰位置不變，峰高峰面積等參數(shù)呈組織特異性變化。這種變化與傳統(tǒng)的MSRE-PCR得到的結果一致，所反映的組織細胞甲基化特征也與文獻報道相符。當前實驗條件下，0.5ng的基因組DNA即可獲得穩(wěn)定的MCA圖譜。加入的基因組DNA在0.5~20ng之間，不影響圖譜的特異性。(2)用PDP-MCA檢測，血斑、唾液斑、精斑、月經(jīng)血斑、陰道液斑各有其特異性的MCA圖譜，HRM差異曲線可以直觀的分出男性生殖斑痕(精斑)、女性生殖斑痕(月經(jīng)血斑和陰道液斑)、非生殖斑痕三大類。對樣本數(shù)據(jù)進行判別分析，得到6個判別方程：Y血＝215.889X1＋351.518X2＋184.426X3＋187.220X4－8944.600，Y唾液＝218.104X1＋357.846X2＋185.441X3＋189.631X4－9160.218，Y精液＝211.353X1＋336.697X2＋181.563X3＋182.828X4－8479.036，Y陰道液＝212.469X1＋348.672X2＋180.079X3＋189.103X4－8702.051，Y月經(jīng)血＝214.026X1＋349.480X2＋182.364X3＋189.059X4－8812.421, Y對照＝209.004X1＋337.309X2＋178.322X3＋187.022X4－8367.215。訓練樣本的總體判別準確率為97.2%，除血斑(83.3%)外，其他斑痕的準確率均為100%。 【結論】(1) PDP-MCA可以實現(xiàn)多個MVP的一步單管、閉管檢測，是一種簡便快速的DNA甲基化分析技術；(2)所調(diào)查的5個MVP片段(MAGE1、14-3-3σ、MCJ、TIMP、HOXA5)在常見法醫(yī)斑痕之間存在甲基化差異，可以作為候選的分子斑痕標記；(3)用PDP-MCA聯(lián)合檢測MAGE1、14-3-3σ、MCJ三個MVP片段，可以鑒別血斑、精斑、唾液斑、月經(jīng)血斑及陰道液斑。
【關鍵詞】：DNA甲基化 斑痕鑒別 鏈融解曲線分析 甲基化敏感性限制酶
【學位授予單位】：河南科技大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2012
【分類號】：D919
【目錄】：

• 摘要2-4
• ABSTRACT4-8
• 第1章 前言8-16
• 1.1 法醫(yī)斑痕鑒別8
• 1.2 斑痕鑒別技術8-10
• 1.3 DNA 甲基化與斑痕鑒別10-12
• 1.4 PDP-MCA 技術簡介12-16
• 第2章 基于 PDP-MCA 的 MVPs 檢測技術16-26
• 2.1 背景16-18
• 2.1.1 儀器16-17
• 2.1.2 試劑17
• 2.1.3 主要試劑的配制17-18
• 2.1.4 樣本18
• 2.2 方法18-21
• 2.2.1 酚∶氯仿∶異戊醇法基因組 DNA 提取18-19
• 2.2.2 DNA 濃度純度測定19
• 2.2.3 引物設計19-20
• 2.2.4 模板的選擇20
• 2.2.5 單管 PDP-MCA 法20
• 2.2.6 傳統(tǒng) MSRE-PCR MCA 法20-21
• 2.2.7 非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測引物片段21
• 2.2.8 數(shù)據(jù)分析21
• 2.3 結果21-26
• 2.3.1 非變性聚丙烯酰胺凝膠圖譜21-22
• 2.3.2 MCA 圖譜22-25
• 2.3.3 數(shù)據(jù)分析25-26
• 第3章 常見斑痕 MVPs 標記的調(diào)查與評價26-40
• 3.1 背景26
• 3.2 材料與方法26-29
• 3.2.1 公共數(shù)據(jù)庫與檢索系統(tǒng)26
• 3.2.2 儀器26-27
• 3.2.3 試劑27
• 3.2.4 樣本27
• 3.2.5 樣本基因組 DNA 的提取、純化和濃度的檢測27-28
• 3.2.6 引物設計28
• 3.2.7 單管 PDP-MCA 法28-29
• 3.3 組織斑痕鑒定數(shù)據(jù)分析29
• 3.4 結果29-40
• 3.4.1 斑痕的特異性 MCA 圖譜29-31
• 3.4.2 圖譜特異性的影響因素31-32
• 3.4.3 結果判別32-34
• 3.4.4 判別分析34-40
• 第4章 血痕鑒別技術進展40-48
• 4.1 概要40
• 4.2 斑痕鑒別的意義40-48
• 4.2.1 預實驗41-42
• 4.2.2 確證試驗42-43
• 4.2.3 新的檢測技術43-45
• 4.2.4 展望45-48
• 第5章 討論48-54
• 5.1 PDP-MCA 技術的原理48
• 5.2 可行性48-49
• 5.3 添加劑的選擇49
• 5.4 優(yōu)勢與問題49-50
• 5.5 MCA/HRM 圖譜分析50-51
• 5.6 StatistiXL 軟件判別分析51
• 5.7 DNA 甲基化斑痕標記的優(yōu)勢51-54
• 第6章 結論54-56
• 參考文獻56-60
• 縮略語詞匯表60-61
• 附錄61-63
• 致謝63-64
• 攻讀碩士學位期間的研究成果64

【參考文獻】

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本文編號：738303