本文關(guān)鍵詞：法醫(yī)毒理學(xué)中藥物代謝與中國(guó)漢族人群CYP基因多態(tài)性的關(guān)聯(lián)分析

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【摘要】：涉毒案件是法醫(yī)學(xué)鑒定的重要內(nèi)容之一。由于人類(lèi)對(duì)毒藥物的代謝存在顯著的個(gè)體差異,因而中毒案件的法醫(yī)毒理學(xué)分析應(yīng)充分考慮個(gè)體遺傳因素,結(jié)合藥物基因組學(xué)進(jìn)行結(jié)果解釋。細(xì)胞色素P450(Cytochrome P450,CYP)是人體中最重要的藥物代謝酶。遺傳機(jī)制的研究顯示,藥物代謝的個(gè)體差異主要由CYP基因多態(tài)性所致,若CYP基因出現(xiàn)堿基缺失、插入、替換、顛換等類(lèi)型的突變,就會(huì)使氨基酸序列改變,導(dǎo)致所表達(dá)的CYP酶降低活性或者喪失活性,最終引起藥物代謝異常而中毒。 單核苷酸多態(tài)性(Single nucleotide polymorphism, SNP)在人類(lèi)基因組中數(shù)量較多,發(fā)生頻率較高,在疾病相關(guān)性研究、藥物基因組學(xué)、法醫(yī)學(xué)等研究中發(fā)揮了重要作用。近年來(lái)基于SNP分型的藥物基因組學(xué)逐漸在毒理學(xué)研究方面嶄露頭角,其不僅可用于篩選異常代謝人群,也可為毒理學(xué)作用機(jī)制的研究提供新的方向和方法�；|(zhì)輔助激光解吸電離質(zhì)譜(Matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrum, MALDI-TOF MS)基因分型技術(shù)因其高靈敏度、高特異性、高通量等優(yōu)點(diǎn),更符合法醫(yī)生物學(xué)檢材的要求,適用于CYP基因的SNP位點(diǎn)分型。生物樣品前處理方法一直以來(lái)是毒物分析的一個(gè)研究難點(diǎn)。分子印跡技術(shù)(Molecular imprinting technique, MIT)是近幾年發(fā)展起來(lái)的新型分子識(shí)別分離技術(shù),因其識(shí)別性好、專(zhuān)一性高,可應(yīng)用于生物檢材中毒藥物及其代謝物的分離分析。 本論文在國(guó)內(nèi)首次針對(duì)中國(guó)漢族人群CYP2D6、CYP2C19、CYP2C9、CYP3A4和CYP1A2基因座上的50個(gè)SNP位點(diǎn)進(jìn)行了大規(guī)模篩查分析,并在現(xiàn)有研究成果以及現(xiàn)代毒物分析技術(shù)和SNP分型技術(shù)的研究基礎(chǔ)和起點(diǎn)上,以司法鑒定實(shí)踐中廣泛涉及的新一代非“苯二氮卓”藥物唑吡坦(Zolpidem,思諾思)和阿片類(lèi)藥物可待因?yàn)檠芯繉?duì)象,創(chuàng)建了體內(nèi)毒藥物及其代謝物的篩選分析體系和確證定量方法,自主研發(fā)了唑吡坦分子印跡固相萃取小柱并申請(qǐng)專(zhuān)利,用于血液和尿液中唑吡坦的分離分析。通過(guò)志愿者實(shí)驗(yàn),首次考察了中國(guó)漢族人群中CYP基因多態(tài)性的分布情況,首先報(bào)道了CYP基因多態(tài)性與唑吡坦及可待因代謝之間的關(guān)系,在國(guó)內(nèi)率先進(jìn)行了將藥物基因組學(xué)應(yīng)用于法醫(yī)毒理學(xué)的探索研究。主要的研究?jī)?nèi)容分為以下七部分： 第一部分CYP基因分型方法的研究及評(píng)價(jià) 研究顯示,CYP2D6, CYP2C19, CYP2C9, CYP3A4和CYP1A2參與了大部分的藥物代謝。篩選出這些基因座上的50個(gè)SNP位點(diǎn),創(chuàng)建了基于復(fù)合PCR和基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時(shí)間質(zhì)譜(MALDI-TOF-MS)技術(shù)的CYP基因分型方法,并檢測(cè)了200例健康中國(guó)漢族人群的血樣,得到了這50個(gè)SNP位點(diǎn)的基因分布頻率。引物是根據(jù)MassARRAY Assay設(shè)計(jì)軟件設(shè)計(jì),由0.5mL全血抽提基因組DNA,經(jīng)過(guò)復(fù)合PCR得到含SNP位點(diǎn)的片段。MALDI-TOF-MS檢測(cè)之前再經(jīng)過(guò)單堿基延伸和產(chǎn)物純化,即得到檢測(cè)結(jié)果。同時(shí)以已知基因型的DNA樣品作為質(zhì)量控制樣品。結(jié)果發(fā)現(xiàn),CYP2D6, CYP2C19, CYP2C9, CYP3A4和CYP1A2基因座上的17個(gè)SNP位點(diǎn)具有多態(tài)性。首次報(bào)道8個(gè)位點(diǎn)(rs16947,rs28371725, rs1800754, rs4244285, rs4986893, rs12248560, rs3758580, rs2242480)的分布頻率在中國(guó)漢族人群和高加索人群中存在顯著性差異(p0.01),2個(gè)位點(diǎn)的分布頻率和現(xiàn)存中國(guó)漢族人群分布頻率之間存在顯著性差異(p0.01)。通過(guò)驗(yàn)證,所建立的MALDI-TOF-MS SNP分型方法的準(zhǔn)確度是100%。因此,該方法檢測(cè)結(jié)果可信且適用于高通量的基因分型研究,提高了法醫(yī)毒理學(xué)中毒藥物相關(guān)基因篩選的效能。 第二部分常見(jiàn)毒藥物的LC-MS/MS篩選體系的建立 為了研究體內(nèi)毒藥物的代謝情況,創(chuàng)建了生物檢材中170種常見(jiàn)毒藥物的液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜(Liquid chromatography-tandem mass spectrometry, LC-MS/MS)篩選分析體系。采用多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(Multiple reaction monitoring, MRM)模式,以目標(biāo)物的保留時(shí)間和母離子／子離子對(duì)為指標(biāo)進(jìn)行篩選分析。建立了LC-MS/MS庫(kù)和定性認(rèn)定標(biāo)準(zhǔn),并考察了分析方法的有效性。多反應(yīng)監(jiān)測(cè)篩選體系兼具有選擇離子掃描的靈敏度和二級(jí)質(zhì)譜的特征性,血液中170種毒藥物篩選分析的最低檢出限為0.1～10ng/mL,其中85%的毒藥物檢出限≤1ng/mL,達(dá)到國(guó)際領(lǐng)先水平。該篩選分析體系能滿足法醫(yī)毒物分析和臨床毒物學(xué)檢測(cè)中毒或治療濃度目標(biāo)物的需要,為其他多種藥物代謝與CYP基因多態(tài)性的關(guān)聯(lián)分析提供了技術(shù)儲(chǔ)備,在司法鑒定實(shí)踐中有重要的應(yīng)用價(jià)值。 第三部分唑吡坦分子印跡固相萃取柱的制備及應(yīng)用 生物樣品尤其是血液、尿液中目標(biāo)物的分離分析技術(shù)是本課題研究的基礎(chǔ)。目前,生物檢材中的唑毗坦分析,主要采用液液提取或固相萃取等前處理后進(jìn)行液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜分析。分子印跡技術(shù)(Molecular imprinting technique, MIT)是近幾年發(fā)展起來(lái)的新型分子識(shí)別分離技術(shù),因其識(shí)別性好、專(zhuān)一性高,可應(yīng)用于生物檢材中毒藥物及其代謝物的分離分析。本課題以唑吡坦為模板,自主研發(fā)了特異性強(qiáng)、選擇性高的分子印跡聚合物提取柱,建立了相應(yīng)的分子印跡固相萃取方法,并申請(qǐng)了一項(xiàng)發(fā)明專(zhuān)利。以血液為檢材,提取物用UPLC-MS/MS方法檢測(cè)分析。對(duì)該方法進(jìn)行方法學(xué)驗(yàn)證,并與傳統(tǒng)的固相萃取技術(shù)進(jìn)行了比較,發(fā)現(xiàn)該分子印跡固相萃取柱選擇性強(qiáng)、靈敏度高(最低檢測(cè)限為0.2ng/mL),適用于法庭科學(xué)領(lǐng)域唑吡坦相關(guān)實(shí)際案例的檢測(cè)分析。 第四部分UPLC-MS/MS法檢測(cè)血液、尿液中的唑吡坦及其代謝物 為研究唑吡坦的體內(nèi)代謝情況,本課題首次建立了同時(shí)檢測(cè)生物檢材中唑吡坦及其主要代謝物6-羧酸唑吡坦(zolpidem6-carboxylic acid, ZCA)及苯基-4-羧酸唑吡坦(Zolpidem phenyl-4-carboxylic acid, ZPCA)的超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜(Ultra-performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry, UPLC-MS/MS)分析方法,并應(yīng)用于鑒定實(shí)踐。取0.1mL血液或尿液,加入0.9mL的乙腈(含0.1%甲酸)進(jìn)行蛋白沉淀。離心后取上清液吹干,用100μL甲醇定容后進(jìn)API4000Q分析,分析柱為AcquityTM UPLC HSS T3(100mm×2.1mm,1.8μm)柱。流動(dòng)相為乙腈和水(含20mmol/L乙酸銨和0.1%甲酸),流速為0.5mL/min。血液中唑吡坦,ZPCA及ZCA的線性范圍分別為0.1-300ng/mL,0.1-500ng/mL,0.1-200ng/mL,尿液中唑吡坦,ZPCA及ZCA的線性范圍分別為0.1-600ng/mL,0.1-600ng/mL,0.1-300ng/mL。三種化合物的檢出限和定量限分別為0.05ng/mL和01ng/mL,方法的線性相關(guān)性≥0.9995,日間和日內(nèi)精密度在10%以?xún)?nèi),回收率為70.0-98.3%,基質(zhì)效應(yīng)為79.5-99.0%。該方法簡(jiǎn)單、快速、靈敏,能夠有效地解決唑吡坦涉藥案件,提高突發(fā)案(事)件的快速鑒定能力。 第五部分唑吡坦代謝與CYP基因多態(tài)性的關(guān)聯(lián)性分析 以臨床廣泛應(yīng)用,并在藥物輔助犯罪案件(Drug-facilitated sexual assault, DFSA)中經(jīng)常涉及到的新一代非“苯二氮卓”藥物唑吡坦為研究對(duì)象,為了考察唑吡坦代謝與CYP基因多態(tài)性的關(guān)聯(lián)性,選取200名漢族健康志愿者分析其基因型,篩選出具有突變基因的人群并分為4組：CYP3A4*18(wild-type, W), CYP2C19*2(W); CYP3A4*18(mutant, M), CYP2C19*2(W):CYP3A4*18(W), CYP2C19*2(M); CYP3A4*18(M), CYP2C19*2(M).志愿者口服治療劑量的酒石酸唑吡坦后采集其血液、尿液樣品進(jìn)行分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn),唑吡坦的氧化代謝主要是通過(guò)細(xì)胞色素氧化酶CYP3A4和CYP2C19的作用。首次報(bào)道,若發(fā)生CYP3A4*18的突變,則會(huì)增強(qiáng)CYP3A4酶的活性,從而引起該基因突變?nèi)巳簩?duì)唑吡坦的代謝增強(qiáng)；若發(fā)生CFP2C19*2的突變,則會(huì)降低CYP2C19酶的活性,從而引起中國(guó)漢族人群對(duì)唑毗坦的弱代謝。該研究成果提出,不同人群對(duì)唑吡坦的代謝存在個(gè)體差異,解釋相關(guān)案件時(shí)應(yīng)充分考慮個(gè)體遺傳因素。 第六部分UPLC-MS/MS法檢測(cè)尿液中的可待因及其代謝物 為研究可待因的體內(nèi)代謝情況,本課題創(chuàng)建了尿液中可待因及其代謝物的超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜分析方法。以嗎啡-d3(MOR-d3)和嗎啡-3-葡萄糖醛酸苷d3(M3G-d3)為內(nèi)標(biāo),尿樣用乙腈沉淀蛋白后,過(guò)SiroccoTM蛋白沉淀板,UPLC-MS/MS法分離檢測(cè)尿樣的中嗎啡(MOR)、嗎啡-3-葡萄糖醛酸苷(M3G)、嗎啡-6-葡萄糖醛酸苷(M6G)和可待因(COD)。尿樣中COD的檢出限為0.2ng/mL,定量限為0.5ng/mL; MOR、M3G和M6G檢出限為0.5ng/mL,定量限為1ng/mL;線性相關(guān)系數(shù)r≥0.999　7;日內(nèi)精密度在5%以?xún)?nèi),日間精密度在10%以?xún)?nèi)；日內(nèi)準(zhǔn)確度大于97%,日間準(zhǔn)確度大于94%,回收率在90%以上,基質(zhì)效應(yīng)在45%-90%。所建方法簡(jiǎn)便、快速、準(zhǔn)確,可適用于法醫(yī)毒理學(xué)中可待因相關(guān)案件的分析鑒定。 第七部分可待因代謝與CYP基因多態(tài)性的關(guān)聯(lián)性分析 以臨床廣泛應(yīng)用,并易造成濫用成癮的藥物可待因?yàn)檠芯繉?duì)象,為了考察可待因代謝與CYP基因多態(tài)性的關(guān)聯(lián)性,選取20名健康志愿者口服治療劑量的復(fù)方磷酸可待因口服溶液后分時(shí)段留尿,采用UPLC-MS/MS方法檢測(cè)。本研究發(fā)現(xiàn),多數(shù)志愿者在單次給藥0.5h內(nèi),MOR、COD濃度即達(dá)到峰值,而M3G濃度則在1h后達(dá)到峰值,M6G濃度在6h時(shí)達(dá)到峰值。另有2名志愿者因rs2242480基因突變(CYP3A4),其嗎啡峰值出現(xiàn)在72h,M3G和M6G峰值也出現(xiàn)在72h,可待因的峰值出現(xiàn)在80h。結(jié)果表明,該2名志愿者可能為可待因慢代謝者(PM),攝入的可待因在人體內(nèi)代謝緩慢,易造成藥物蓄積。同時(shí)指出,CYP2D6基因突變易造成超強(qiáng)代謝者(UM),導(dǎo)致嗎啡過(guò)量而引起中毒,但本項(xiàng)研究尚未發(fā)現(xiàn)有超強(qiáng)代謝者。 小結(jié) 本課題創(chuàng)建了基于復(fù)合PCR和MALDI-TOF MS的中國(guó)漢族人群CYP基因座上50個(gè)SNP位點(diǎn)的基因分型方法,首次報(bào)道8個(gè)位點(diǎn)的分布頻率在中國(guó)漢族人群和高加索人群中存在顯著性差異(p0.01),2個(gè)位點(diǎn)的分布頻率和現(xiàn)存中國(guó)漢族人群分布頻率之間存在顯著性差異(p0.01)。該方法檢測(cè)結(jié)果可信且適用于高通量的基因分型研究,提高了法醫(yī)毒理學(xué)中毒藥物相關(guān)基因篩選的效能。同時(shí)本研究首次建立了唑吡坦及其代謝物、可待因及其代謝物的UPLC-MS/MS確證定量分析方法,并自主研發(fā)了唑吡坦分子印跡固相萃取柱用于唑吡坦的分離分析,申請(qǐng)發(fā)明專(zhuān)利一項(xiàng)。本論文還建立了170種毒藥物的LC-MS/MS分析篩選體系,為其他多種藥物代謝與CYP基因多態(tài)性的關(guān)聯(lián)分析提供了技術(shù)儲(chǔ)備。所建方法簡(jiǎn)便、快速、準(zhǔn)確,能夠有效地解決攝毒、涉藥案件,提高突發(fā)案(事)件的快速反應(yīng)能力和鑒定效能。 在國(guó)內(nèi)率先通過(guò)志愿者實(shí)驗(yàn),考察了唑吡坦、可待因代謝與CYP基因多態(tài)性的關(guān)聯(lián)性。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：唑吡坦的氧化代謝主要是通過(guò)細(xì)胞色素氧化酶CYP3A4和CYP2C19的作用。若發(fā)生CYP3A4*18的突變,則會(huì)增強(qiáng)CYP3A4酶的活性,從而引起該基因突變?nèi)巳簩?duì)唑吡坦的代謝增強(qiáng)。若發(fā)生CYP2C19*2的突變,則會(huì)降低CYP2C19酶的活性,從而引起中國(guó)漢族人群對(duì)唑吡坦的弱代謝。可待因的代謝主要是通過(guò)CYP2D6和CYP3A4,若發(fā)生CYP2D6基因突變則易引起超強(qiáng)代謝類(lèi)型,若發(fā)生CYP3A4突變則易會(huì)引起可待因弱代謝型。 本研究首次報(bào)道了CYP基因多態(tài)性與唑吡坦及可待因代謝之間的關(guān)系,在國(guó)內(nèi)率先進(jìn)行了將藥物基因組學(xué)應(yīng)用于法醫(yī)毒理學(xué)的探索研究,該研究結(jié)果可用于解釋不同人群對(duì)唑吡坦及可待因代謝的差異。本研究指出,個(gè)體基因差異對(duì)藥物代謝的影響在臨床醫(yī)學(xué)和法庭科學(xué)領(lǐng)域均具有重要的意義。
【關(guān)鍵詞】：藥物代謝 CYP 基因多態(tài)性 唑吡坦 可待因
【學(xué)位授予單位】：復(fù)旦大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類(lèi)號(hào)】：D919
【目錄】：

• 英文縮略語(yǔ)注釋4-5
• 中文摘要5-10
• Abstract10-16
• 前言16-20
• 第一部分 CYP基因分型方法的研究及評(píng)價(jià)20-32
• 1.材料與方法20-24
• 2.結(jié)果24-30
• 3.討論30-31
• 4.結(jié)論31-32
• 第二部分 常見(jiàn)毒藥物的LC-MS/MS篩選體系的建立32-40
• 1.材料和方法32-33
• 2.結(jié)果和討論33-38
• 3.結(jié)論38-40
• 第三部分 唑吡坦分子印跡固相萃取柱的制備及應(yīng)用40-48
• 1.分子印跡技術(shù)原理40-42
• 2.材料與方法42-43
• 3.結(jié)果與討論43-47
• 4.結(jié)論47-48
• 第四部分 UPLC-MS/MS法檢測(cè)血液、尿液中唑吡坦及其代謝物48-63
• 1.材料與方法49-51
• 2.結(jié)果與討論51-62
• 3.結(jié)論62-63
• 第五部分 唑吡坦代謝與CYP基因多態(tài)性的關(guān)聯(lián)分析63-80
• —、志愿者蹄選試驗(yàn)63-72
• 二、志愿者服藥試驗(yàn)及唾啦坦代謝與基因型的關(guān)聯(lián)性分析72-80
• 第六部分 UPLC-MS/MS法檢測(cè)尿液中的可待因及其代謝物80-88
• 1 材料與方法80-83
• 2 結(jié)果與討論83-87
• 3 結(jié)論87-88
• 第七部分 可待因代謝與CYP基因多態(tài)性的關(guān)聯(lián)分析88-94
• 1.材料與方法89-90
• 2.結(jié)果與討論90-93
• 3.結(jié)論93-94
• 結(jié)語(yǔ)94-95
• 本研究創(chuàng)新點(diǎn)95-96
• 展望96-97
• 參考文獻(xiàn)97-107
• 綜述107-117
• 參考文獻(xiàn)114-117
• 附錄117-119
• 致謝119-121

【參考文獻(xiàn)】

中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前10條

1 向平;沈敏;沈保華;馬棟;卜俊;姜宴;卓先義;;生物檢材中嗎啡類(lèi)生物堿的LC-MS/MS分析[J];法醫(yī)學(xué)雜志;2006年01期

2 付良青,吳德政;細(xì)胞色素P4502D6的研究進(jìn)展[J];中國(guó)臨床藥理學(xué)雜志;2000年06期

3 張貴寅;藥物基因組學(xué)的研究進(jìn)展[J];國(guó)外醫(yī)學(xué).遺傳學(xué)分冊(cè);2004年05期

4 賴(lài)源發(fā);張桂鳳;游勇基;;分子印跡技術(shù)原理及其在藥物分析檢測(cè)中的應(yīng)用[J];海峽藥學(xué);2009年06期

5 肖勇;楊磊;夏東亞;郭濤;鄭誼;劉鵬;王寧芹;郭紅亮;申玉強(qiáng);李偉;白少柏;;口服酒石酸唑吡坦片在中國(guó)漢族和回族健康志愿者體內(nèi)的藥代動(dòng)力學(xué)[J];解放軍藥學(xué)學(xué)報(bào);2011年03期

6 劉陽(yáng);;唑吡旦的不良反應(yīng)[J];臨床薈萃;2008年22期

7 張曉萍;;揭秘“藥物成癮”[J];民主與法制;2009年05期

8 徐月萍,吳伯鏞;細(xì)胞色素P450酶系與代謝性藥物相互作用[J];現(xiàn)代實(shí)用醫(yī)學(xué);2002年10期

9 李莉;李成濤;趙書(shū)民;張素華;向平;;乙醇、乙醛慢代謝與酒后駕車(chē)肇事[J];中國(guó)司法鑒定;2010年01期

10 李后開(kāi);王一煌;賈偉;周明眉;劉平;;藥物基因組學(xué)、藥物代謝組學(xué)與辨證施治[J];世界科學(xué)技術(shù)-中醫(yī)藥現(xiàn)代化;2007年02期

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本文編號(hào)：644050