本文關(guān)鍵詞：COLD-PCR用于混合檢材中微量等位基因富集的可行性

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【摘要】：背景來自兩個或兩個以上個體的混合檢材是法醫(yī)物證檢驗中經(jīng)常遇到的疑難檢材類型之一。隨著高靈敏檢測技術(shù)、高多態(tài)性和性連鎖等特殊遺傳標(biāo)記的普及應(yīng)用,從混合檢材中獲取證據(jù)信息的能力不斷提高。但即使對于經(jīng)驗豐富的專家來說,實際案件中一些混合檢材的檢測和結(jié)果解釋仍然是一個巨大的挑戰(zhàn)。如何對組份含量差異較大的混合檢材中的少量成份進(jìn)行分型,是當(dāng)前法醫(yī)DNA分析的難題之一。 目的建立人類Y染色體M175插入/缺失基因座的COLD-PCR(co-ampLification at lower denaturation temperature PCR)技術(shù),比較COLD-PCR與常規(guī)PCR對不同比例混合樣品的擴(kuò)增分型效果,初步探討COLD-PCR用于法醫(yī)混合檢材中低水平等位基因富集擴(kuò)增分型的可行性。 方法首先建立人Y-M175基因座的常規(guī)PCR-聚丙烯酰胺凝膠電泳(PCR-PAGE)銀染法分型技術(shù),調(diào)查103名河南漢族男性無關(guān)志愿者的基因型。用蛋白酶K消化-酚/氯仿法提取插入和缺失型個體的基因組DNA,按不同比例混合制備成混合樣品。用梯度保溫異源雙鏈消減法測定M175大擴(kuò)增子(171/166bp)的臨界變性溫度(critical denaturation temperature,Tc),高分辨率熔解率曲線法(high resolution melting analysis,HRM)測定M175短擴(kuò)增子(91/86bp)的Tc值。以Tc值為基礎(chǔ),通過在常規(guī)PCR的變性和退火之間增加擴(kuò)增產(chǎn)物雜交和異源雙鏈變性兩個步驟,分別建立和優(yōu)化基于PAGE-銀染法(大擴(kuò)增子)和實時定量法(小擴(kuò)增子)的COLD-PCR技術(shù),比較常規(guī)PCR和COLD-PCR對不同比例混合樣品的擴(kuò)增分型效果。 結(jié)果河南漢族Y-M175基因座插入和缺失型的頻率分別為0.1650、0.8350。M175大擴(kuò)增子的Tc值為76.4℃,小擴(kuò)增子的Tc值為78.4℃,優(yōu)化后采用的COLD-PCR異源雙鏈變性溫度分別為76.4和78.2℃。大擴(kuò)增子PAGE-銀染法,常規(guī)PCR可以有效分型的混合樣品的組分比例為5∶1,而COLD-PCR至少可以達(dá)到20∶1。小擴(kuò)增子實時定量法,常規(guī)PCR可以有效分型的混合樣品的組分比例為16∶1,而COLD-PCR至少可以達(dá)到64∶1。 結(jié)論使用與常規(guī)PCR相同的設(shè)備和試劑, COLD-PCR能實現(xiàn)混合樣品中微量等位基因的富集擴(kuò)增,擴(kuò)大可分型混合檢材的范圍,改進(jìn)分型效果,在混合檢材的法醫(yī)DNA分型中有潛在應(yīng)用價值。
【關(guān)鍵詞】：混合檢材 聚合酶鏈反應(yīng) 異源雙鏈 富集
【學(xué)位授予單位】：河南科技大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2011
【分類號】：D919.2
【目錄】：

• 摘要2-4
• ABSTRACT4-9
• 第1章 緒論9-13
• 1.1 法醫(yī)混合檢材9
• 1.2 法醫(yī)混合檢材鑒定研究現(xiàn)狀9-11
• 1.2.1 混合成份分離法10
• 1.2.2 性別特異性遺傳標(biāo)記法10
• 1.2.3 高多態(tài)性遺傳標(biāo)記結(jié)合高靈敏檢測技術(shù)法10-11
• 1.2.4 混合檢材中組織細(xì)胞成分差異較大的個體的基因分型11
• 1.3 COLD-PCR 簡介11-13
• 第2章 河南漢族 Y 染色 M175 基因座的遺傳多態(tài)性13-17
• 2.1 背景13
• 2.2 材料13-14
• 2.2.1 儀器13
• 2.2.2 主要試劑13
• 2.2.3 試劑配制13-14
• 2.2.4 樣本14
• 2.3 方法14-15
• 2.3.1 Chelex-100 快速提取法14
• 2.3.2 引物設(shè)計14-15
• 2.3.3 PCR 擴(kuò)增15
• 2.3.4 非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳分離15
• 2.3.5 統(tǒng)計學(xué)分析15
• 2.4 結(jié)果15-17
• 第3章 普通 PCR 儀下使用 COLD-PCR 檢測混合檢材中的微量成分17-23
• 3.1 背景17
• 3.2 材料17-18
• 3.2.1 儀器17
• 3.2.2 主要試劑17-18
• 3.2.3 試劑配制18
• 3.2.4 樣本18
• 3.3 方法18-21
• 3.3.1 Chelex-100 快速提取法18-19
• 3.3.2 蛋白酶K-酚-氯仿提取法19
• 3.3.3 濃度檢測19
• 3.3.4 混合樣品準(zhǔn)備19-20
• 3.3.5 引物設(shè)計20
• 3.3.6 Tc 值的測定20
• 3.3.7 COLD-PCR 擴(kuò)增20-21
• 3.3.8 非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳分離COLD-PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物21
• 3.4 結(jié)果21-23
• 3.4.1 Tc 值21-22
• 3.4.2 COLD-PCR 及與其富集效果22-23
• 第4章 實時定量 PCR 檢測技術(shù)與 COLD-PCR 結(jié)合檢測混合檢材中的微量成分23-30
• 4.1 背景23
• 4.2 材料23-24
• 4.2.1 儀器23
• 4.2.2 主要試劑23
• 4.2.3 試劑配制23-24
• 4.2.4 樣本24
• 4.3 方法24-26
• 4.3.1 蛋白酶K-酚-氯仿提取法24-25
• 4.3.2 混合樣品準(zhǔn)備25
• 4.3.3 引物設(shè)計25
• 4.3.4 應(yīng)用實時定量PCR 儀的常規(guī)PCR25-26
• 4.3.5 異源雙鏈 Tm 值的HMR 測定26
• 4.3.6 COLD-PCR 擴(kuò)增26
• 4.4 結(jié)果26-30
• 4.4.1 Y-M175 基因座短擴(kuò)增子PCR 的建立及Tm 值測定26-27
• 4.4.2 Y-M175 基因座短擴(kuò)增子異源雙鏈Tm 值及COLD-PCR Tc 值的測定27-28
• 4.4.3 COLD-PCR 及其富集效果28-30
• 第5章 討論30-34
• 5.1 COLD-PCR 的原理30
• 5.2 Tc 值及其測定30-31
• 5.3 COLD-PCR 程序31
• 5.4 Y-M175 基因座COLD-PCR 富集分型效果31-32
• 5.5 EvaGreen 熒光染料的選擇32
• 5.6 法醫(yī)學(xué)應(yīng)用前景與存在的問題32-34
• 第6章 結(jié)論34-36
• 第7章 綜述混合檢材中的微量等位基因富集技術(shù)進(jìn)展36-42
• 7.1 概要36-37
• 7.2 對已知突變選擇性和富集的一般方法37-38
• 7.3 對已知突變有較高選擇性和富集的方法38-40
• 7.4 根據(jù)突變序列富集未知突變40-42
• 參考文獻(xiàn)42-48
• 縮略語詞匯表48-50
• 附錄A 論文50-60
• 致謝60-61
• 攻讀碩士學(xué)位期間的研究成果61

【參考文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 唐雙柏,郭景元,劉超,李越;混合生物檢材的個人識別及研究進(jìn)展[J];中國法醫(yī)學(xué)雜志;2000年02期

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5 李鑫;胡蘭;郭紅玲;劉志芳;Q謎，

本文編號：560216