【摘要】： 尸體化學研究尸體血液、腦脊液、玻璃體液(vitreous humour, VH)以及其它體液中化學成分的死后變化。玻璃體液具有解剖位置相對隔離、不易受到污染和死后變化、腐敗緩慢等特點，是尸體化學研究的理想檢材。死亡時間推斷是法醫(yī)病理學研究的首要任務之一，VH成分死后變化與PMI關系也成為國內(nèi)外法醫(yī)學研究的熱點。近年來，研究重點集中到提高推斷準確度上，，包括取樣方法、成分選擇以及PMI推斷方程建立方法等。 本文重點探索VH微量取樣方法及推斷方程置信區(qū)間的作用，分述如下： 第一部分微量取樣VH的方法研究 VH在尸體化學研究中占有重要位置。眼科生理學研究認為玻璃體內(nèi)各部分物質(zhì)含量不均一，即存在“濃度梯度”，Coe因此認為應一次取出所有VH以避免其影響樣本物質(zhì)含量。隨著檢驗技術的提高，近年有學者提出了微量或部分取樣VH。還有學者觀察認為雙眼VH物質(zhì)含量也不一致，或死后改變不同步。上述爭議影響了VH的取樣和研究方法，未見取樣方法專項研究報道。 本部分采用動物實驗，初步探討樣本物質(zhì)含量與眼內(nèi)濃度梯度和雙眼濃度差的關系，比較微量取樣與一次取樣的差異，以及間隔取樣的可行性及對PMI研究的影響。在法醫(yī)學界首次研究了VH微量重復取樣和間隔微量取樣的可行性，為人體研究提供取樣方法準備。 實驗1 VH鈣、鉀、鈉、氯、磷含量與濃度差的研究 目的研究VH樣本鈣、鉀、鈉、氯、磷含量與眼內(nèi)“濃度梯度”的關系，以及雙眼VH樣本物質(zhì)含量及其死后變化是否一致，研究重復微量取樣的可行性以及是否存在雙眼濃度差異。 方法28只健康家兔隨機分為3組：(1)組：家兔10只，按Coe提倡的方法，于PMI12h雙眼分別一次取出所有VH；(2)組：動物9只，于PMI12h雙眼分別微量取樣50μl、連續(xù)取15次；(3)組：動物9只，于PMI120h雙眼分別微量取樣50μl、連續(xù)取15次。檢測鈣、氯、鉀、鈉離子和無機磷含量，各組雙眼配對t檢驗，(2)、(3)組微量重復取樣的方差分析及時間、左右眼分組兩個分組因素的方差分析等。 結果(2)、(3)組微量重復取樣樣本總體無差異(P＞0.05)；(1)、(2)、(3)組雙眼組分含量無差異(P＞0.05)。 結論死后VH雙眼物質(zhì)含量及死后變化一致；所謂玻璃液濃度梯度未顯著影響微量重復取樣樣本的物質(zhì)含量，微量重復取樣樣本總體一致。 實驗2微量取樣與一次取樣VH的比較研究 目的比較微量取樣與一次取樣的差異，研究兩種取樣方法對樣本物質(zhì)含量的影響。 方法健康家兔36只隨即分為4組：①組于PMI12h雙眼分別一次取出所有VH；②組于PMI12h雙眼分別取樣50μl、連續(xù)取15次；③組于PMI12h取樣：右眼(同②組)取樣50μl、連續(xù)取15次；左眼(同①組)一次取出所有VH；④組：于PMI12h雙眼先后2次取樣，先微量取樣50μl(同②組)，剩余VH一次取出(同①組)。檢測鈣、氯、鉀、鈉離子和無機磷等含量，統(tǒng)計分析各實驗組(次)VH物質(zhì)含量變異系數(shù)，③組雙眼配對t檢驗比較兩取樣方法獲得的樣本均數(shù)。 結果①組鈣、氯、鉀、鈉離子和無機磷的變異系數(shù)為25.97％，17.87％，33.92％，21.58％和40.01％，較②組平均變異系數(shù)鈣10.08％，氯4.76％，鉀11.35％，鈉5.30％，磷17.70％顯著較高。③組左眼與右眼的平均變異系數(shù)為：鈣24.62％和10.23％，氯20.83％和5.25％，鉀37.64％和11.50％，鈉22.53％和4.88％，磷41.08％和17.02％；左右眼配對t檢驗無差異(P＞0.05)。④組先后兩次取樣的變異系數(shù)為：鈣9.73％和18.55％，氯4.20％和15.08％，鉀10.16％和19.95％，鈉4.46％和21.36％，磷17.71％和35.12％；第1次取樣雙眼濃度差與均數(shù)的平均比為2.122％～17.972％，第2次取樣為15.091％～35.992％。 結論一次取樣與微量取樣VH物質(zhì)含量總體一致，但是取樣方法對樣本物質(zhì)含量的離散度有影響。一次取樣樣本的變異程度和雙眼間濃度差的彌散程度較大；微量取樣的穩(wěn)定性、可重復性較好，更適于VH死后研究。 實驗3間隔多次微量取樣玻璃體液研究 目的探索間隔多次微量取樣的可行性，以及對PMI研究的影響。 方法健康家兔99只分為7組，(1)至(6)組每組9只，(7)組45只。(1)至(5)組左眼為實驗組，間隔12h、多次取樣50μl，分別至死后24h、48h、72h、96h和120h；右眼為對照組，于死后24h、48h、72h、96h和120h取樣50μl一次。檢測鈣、鉀、鈉、氯離子和無機磷含量，實驗組與對照組按同一動物配對t檢驗。(6)組9只家兔，右眼于死后12h、36h、60h、84h、108h，左眼于死后24h、48h、72h、96h、120h分別取樣50μl；(7)組45只動物(90眼)編號分為10組，于12h、36h、48h、60h、72h、84h、96h、108h和120h取1組(10眼)取樣50μl 1次。檢測鈣、鉀和鈉離子含量，(6)組與(7)組鈣、鉀和鈉含量差值t檢驗及PMI回歸方程的比較分析。 結果(1)至(4)組配對t檢驗鈣、鉀、鈉、氯離子和無機磷含量無差異(P＞0.05)；(5)組鉀含量有差異(P=0.025)，而鈣、氯、鈉離子和無機磷含量無差異(P＞0.05)。(6)組與(7)組組間鈣、鉀、鈉離子含量差值t檢驗無差異(P＞0.05)。(6)組與(7)組鉀、鈉離子PMI回歸方程的比較分析無差異(P＞0.05)；鈣離子含量均與PMI無相關性。 結論PMI96h內(nèi)，間隔微量取樣未顯著影響VH鈣、鉀、鈉、氯離子和無機磷等物質(zhì)含量的死后變化；間隔時間、雙眼交替微量取樣對鈣、鉀和鈉死后變化趨勢無影響，可以替代傳統(tǒng)一次取樣方法成為玻璃體液PMI研究的取樣方法之一。 第二部分VH成分死后變化及角膜上皮基底細胞核DNA含量變化與PMI關系的研究 推斷死亡時間是VH研究的重要課題之一。迄今為止PMI推斷方程不一、推斷準確度不高。有學者提出對死因、年齡、溫度等進行控制、VH多成分研究建立多元推斷方程、以PMI為自變量建立推斷方程等以提高推斷準確度，部分國外學者還注意到了置信區(qū)間對總體推斷結果的影響。 本部分采用動物實驗，運用第一部分的研究成果，間隔微量取樣觀察了VH鉀、鈉、鎂、銨離子的死后變化；結合本系在檢測DNA含量推斷PMI研究領域的豐富經(jīng)驗，研究了排列規(guī)則、成分單一的角膜上皮基底細胞DNA含量相關7個參數(shù)的死后變化。從置信區(qū)間角度討論各參數(shù)PMI推斷價值，并在多指標、參數(shù)范圍探討多元擬合推斷方程的意義。這項研究為國內(nèi)PMI推斷引入了評價新標準，為今后研究指標篩選和建立多元分析提供重要方法參考。 實驗4間隔取樣VH檢測鉀、鈉、鎂、銨含量推斷PMI研究 目的雙眼交替間隔取樣、觀察家兔VH鉀、鈉、鎂和銨等離子含量死后變化，結合置信區(qū)間評估各參數(shù)的PMI推斷價值。 方法健康家兔12只，分為2組。實驗組動物9只，雙眼間隔12h、交替微量取樣50μl至PMI96h。檢測鉀、鈉、鎂和銨離子含量，分析含量變化規(guī)律與PMI的關系，建立PMI推斷方程、評估95％推測置信區(qū)間。測試組動物3只，于PMI12h～96h內(nèi)隨機選取實驗時間12h，24h，60h，78h，84h和96h，取樣50μl。檢測鉀、鈉、鎂和銨離子含量，測試實驗組各參數(shù)推斷方程的推測偏差。 結果實驗組鉀、鎂和銨離子隨PMI增高，鈉離子含量下降，死后變化均與PMI顯著相關(P＜0.001)，確定系數(shù)均在0.95以上。建立的PMI推斷方程為：鉀(X_1)：Y_1=12.038-1.272X_1+0.123X_1~2(r~2=0.9970)；鈉(X_2)：Y_2=438.346-3.177X_2(r~2=0.9864)；鎂(X_3)：Y_3=259.158X_3-53.455X_3~2-216.430(r~2=0.9388)；銨(X_4)：Y_4=0.072X_4-40.827(r~2=0.9566)。鈉和鎂方程的平均誤差為15.25h和13.51h；鉀和銨為8.897h和8.084h。鉀推斷方程平均95％置信區(qū)間約為±9h，但隨PMI逐步增大，死后72h達±14h左右；而銨、鎂、鈉推測方程95％置信區(qū)間基本穩(wěn)定，分別約為±6h，±13h和15h。檢測組檢測鉀、鎂、銨推導方程平均偏差分別為6.48h，7.13h和9.29h，而鈉高達19.34h。 結論死后96h內(nèi)，VH鉀、鈉、鎂、銨離子含量變化均與PMI相關，可建立推斷方程。推斷方程及其置信區(qū)間均與PMI推斷準確度有關，評價方程時應考慮推斷置信區(qū)間：鈉、鎂方程的95％置信區(qū)間為13h～15h，整體PMI價值偏低；鉀95％置信區(qū)間隨PMI逐步擴大，可能影響PMI72h以后的推測精度。綜合考慮，72hPMI內(nèi)，鉀研究價值較高；而死后24h～96h內(nèi)銨的研究價值較大。 實驗5角膜上皮基底細胞DNA含量以及VH鉀、鈉含量與PMI關系的研究 目的運用圖像分析技術，研究家兔角膜上皮基底細胞DNA含量變化與PMI的關系；并結合實驗4觀察結果，探索多元PMI推斷方程對推斷準確度的影響。 方法健康家兔36只，單眼編號后隨機分為12組(每組6目)，分別于死后0h、6h、12h、24h、36h、48h、60h、72h、84h、96h、108h、120h分組取材固定，切片F(xiàn)eulgen染色，利用圖像分析技術檢測角膜上皮基底細胞核DNA面積(A)、等效直徑(MD)、異形指數(shù)(ID)、平均光度(AOD)、積分光度(IOD)、密度變化數(shù)(LDC)和平均灰度(AG)等參數(shù)指標，觀察參數(shù)變化與PMI的關系。最后選取PMI12h至96h，與實驗4的觀察結果擬建多元推斷方程，結合95％置信區(qū)間，評估比較單參數(shù)方程、多元方程推斷PMI的準確性。 結果上述7個DNA參數(shù)變化均與PMI顯著相關(P＜0.001)，相關系數(shù)為0.9511～0.9929。推斷偏差分析顯示，面積(A)推斷方程平均推斷偏差11.001h，MD為55.452h，ID為76.687h，AOD為48.405h，IOD為3.165h，LDC為35.197h，AG為8.918h。12h～96hPMI，AG(X_7)與VH鈉(X_8)可擬建多元推斷方程：Y_1=451.103-2.412X_8-0.576X_7(r~2=0.9975)，95％置信區(qū)間和平均預測準確度較單一的VH鈉或AG推斷方程更好。其它不能擬合有意義的多元方程，如AG(X_7)與VH鉀(X_9)擬合的PMI推斷方程為Y_2=7.424X_9+1.860X_7-457.655(r~2=0.9812)，該方程對置信區(qū)間無顯著影響。 結論死后120h內(nèi)，家兔角膜上皮基底細胞DNA含量與死亡時間相關，其中A、IOD和AG建立的PMI推斷方程平均推斷偏差較小，具有較高研究價值。擬建多元方程應進行統(tǒng)計分析和置信區(qū)間測算；死后12h～96h，同時觀測VH鈉含量及角膜上皮基底細胞細胞核DNA平均灰度(AG)的死后變化，可顯著提高推斷準確性。
【圖文】：

中科技大學向擠醫(yī)學院博士學位論2.統(tǒng)計(1)一(5)組左眼(實驗組)與右眼(對照組)配對t檢驗見表3一3，(5)組鉀含量:p值為0.0251，小于0.05。(6)組與(7)組差值t檢驗:鈣離子尸值為0.270.1307，鈉0.1702，均大于0.05，雙眼含量無差異;其鉀、鈉離子變化趨3一1、3一2，兩組鈣離子含量均與PMI無關。

華中科技丈學溝濟醫(yī)學院博士學位3一3.(1卜(5)組左、右眼鈣、氯、鉀、鈉離子和無機磷含量配對t檢驗(P值)able3一3PvalueofPair一matchlngt一testbetweenleftandrighteyesingrouP1toV實驗組PMI(h)e擴+el一K+Na+124064330.836602324024140.248026550.53120.1078043180乃3720.972602785048360.37940.496079830.18260.8385026450451200.72690.13020.0251*027430.*根據(jù)(5)組結果，將觀察時間限定在96h以內(nèi)。(6)組與(7)組鉀、鈉離回歸方程的比較分析:兩者在截距和斜率上均無差異(尸>0.05，見表3一)，兩組鉀、鈉PMI變化趨勢一致。(6)組鉀(X，)PMI推斷方程:Yl一4.ol7XI一38一0.9649;鈉(xZ)為YZ一435，35一3.177地，產(chǎn)一0.9864。(7)組鉀(x3)P瓏推斷Y3科.097x3一37.450，產(chǎn)一。，9535;鈉((沁)為h科15.92一2.96ox4，r2一0.9695。兩離子P叨推斷方程及95%置信區(qū)間圖示見圖3一3、圖3一4。
【學位授予單位】：華中科技大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2006
【分類號】：D919

【引證文獻】

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1 徐升橋;用于推斷死亡時間的便攜式玻璃體液鉀鈉離子濃度檢測系統(tǒng)設計[D];中南大學;2011年

本文編號：2546427