【摘要】： 目的： 為提高線粒體DNA(mitochondrial DNA，mtDNA)遺傳標記的個人識別能力和非母排除能力，篩選線粒體DNA編碼區(qū)頻率較好的單核苷酸多態(tài)(single nucleotide polymorphism SNP)基因座，利用復合MS-PCR(multiplexed mutagenically separated PCR)技術、銀染分型，建立線粒體DNA編碼區(qū)10個SNP基因座復合擴增分型系統(tǒng)，以期為法醫(yī)鑒定提供mtDNA-SNP新的遺傳標記和新的檢測手段，并探討其應用價值；同時調(diào)查160例中國成都無關漢族個體mtDNA編碼區(qū)10個SNP基因座等位基因頻率和單倍型分布情況，為群體遺傳學提供新的數(shù)據(jù)。 方法： 從線粒體DNA編碼區(qū)篩選多態(tài)性較好的10個SNP(T12705C，G8701A，A8584G，T10400C，T4883C，C10873T，A15301G，C14783T，A3010G，A5460G)基因座。針對每個SNP基因座分別設計兩條片段相差3～4個堿基的等位基因特異性引物和一條公共引物，優(yōu)化擴增條件，使10個SNP基因座同時在一管中擴增，PCR產(chǎn)物經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳、銀染顯帶后分析樣本的基因型。應用直接測序技術以T12705C、C10873T和A5460G基因座為例研究該方法檢測的準確性。 結果： 本研究成功建立了10個mtDNA-SNP基因座復合擴增，聚丙烯酰胺凝膠電泳、銀染顯帶分型的方法；不同SNP基因座為長度不同的單一譜帶，其分型結果與直接測序一致；用上述方法對成都漢族160名無關個體10個mtDNA-SNP基因座進行了準確分型，分型結果可靠，重復性好。10個mtDNA-SNP基因座C12705T、A8701G、G8584A、C10400T，，T4883C、C10873T、A15301G、C14783T、A3010G、A5460G等位基因頻率分別為0．382／0．618、0．482／0．518、0．825／0．175、0．494／0．506、0．169／0．831、0．513／0．487、0．538／0．462、0．506／0．494、0．163／0．837、0．09／0．91，共檢出18種單倍型，單倍型的基因多樣性為0．8617，偶合概率值為0．1437。 結論： 本研究通過自行設計的10套引物，成功的構建了10個線粒體SNP基因座復合MS-PCR擴增、銀染分型體系。為提高mtDNA-SNP基因座的個人識別能力和非母排除能力提供了一種簡單、快速、準確、經(jīng)濟、有效的SNP分型新方法；對建立線粒體DNA-SNP數(shù)據(jù)庫，為線粒體SNP基因座在考古學、進化學和法醫(yī)學個人識別和親子鑒定提供了方法學和群體遺傳學基礎。
[Abstract]:Objective: to improve the ability of individual identification and non-maternal exclusion of mitochondrial DNA (mitochondrial DNA,mtDNA (mtDNA) markers, and to screen single nucleotide polymorphic (single nucleotide polymorphism SNP) loci with better frequency of mitochondrial DNA coding region. A multiplex amplification typing system for 10 SNP loci of mitochondrial DNA coding region was established by using compound MS-PCR (multiplexed mutagenically separated PCR) technique and silver staining typing, in order to provide a new mtDNA-SNP genetic marker and a new detection method for forensic identification. And discusses its application value; The alleles frequency and haplotype distribution of 10 SNP loci in the mtDNA coding region of 160 unrelated Han individuals in Chengdu, China, were also investigated in order to provide new data for population genetics. Methods: ten polymorphic SNP loci (T12705CnG8701A, T10400CnT4883T10873T10873TC14783TC14783TFA3010GnA5460G) were screened from the mitochondrial DNA coding region. Two allele-specific primers and one common primer were designed for each SNP locus. The amplification conditions were optimized, and 10 SNP loci were amplified in one tube at the same time. The PCR products were analyzed by polyacrylamide gel electrophoresis and silver staining. The accuracy of this method was studied by using direct sequencing technique with T12705CnC10873T and A5460G loci as examples. Results: ten mtDNA-SNP loci were successfully amplified, polyacrylamide gel electrophoresis and silver staining banding. Different SNP loci were single bands of different length, and the typing results were consistent with direct sequencing. Using the above method, 10 mtDNA-SNP loci of 160 unrelated individuals in Chengdu Han nationality were accurately typed. The results of typing were reliable and reproducible. Ten mtDNA-SNP loci C12705TnA8701GGN G8584AC10400 T10400 T10883 C10873TUA15301GC14783TA3010G, C14783TA3010G. The allele frequency of A5460G is 0.382 / 0.618 / 0.482 / 0.518 / 0.825 / 0.175 / 0.494 / 0.506n 0.169r0.831 / 0.5130.538 / 0.462n 0.506 / 0.494r0.1630.163 / 0.830.09 / 0.991, respectively. A total of 18 haplotypes were identified. The genetic diversity of haplotypes was 0.8617 and the probability of coupling was 0.1437. Conclusion: in this study, 10 mtDNA loci were successfully amplified by 10 sets of primers designed by ourselves, and the silver staining typing system was constructed. It provides a simple, rapid, accurate, economical and effective method for SNP typing in order to improve the ability of individual recognition and non-maternal exclusion of mtDNA-SNP loci. The establishment of mitochondrial DNA-SNP database provides methodology and population genetic basis for mitochondrial SNP locus identification in archaeology, advanced chemistry and forensic medicine.
【學位授予單位】：四川大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2007
【分類號】：D919

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本文編號：2417706