【摘要】：目的 1.建立生物檢材中氯氮平的氣相色譜和氣相色譜/質(zhì)譜檢測方法; 2.建立氯氮平的毒物動力學(xué)、動態(tài)分布、死后分布、死后再分布、死后彌散、分解動力學(xué)動物模型; 3.研究氯氮平在實驗動物體內(nèi)的毒物動力學(xué)、動態(tài)分布、死后分布、死后再分布、分解動力學(xué)規(guī)律,為氯氮平中毒(死)案件的法醫(yī)學(xué)鑒定提供實驗依據(jù)。 方法 1.樣品的處理和氣相色譜、氣相色譜/質(zhì)譜檢測:血、組織樣品中加入內(nèi)標(biāo)物SKF525A,經(jīng)0.5moL/L NaOH溶液調(diào)pH=10,乙醚萃取,薄層色譜掃描、氣相色譜、氣相色譜/質(zhì)譜聯(lián)用法定性,定量檢測氯氮平含量。 2.毒物動力學(xué):雄性家兔6只,隨即分為兩組,分別用1/2LD50(135 mg/kg)與LD50(270 mg/kg)劑量灌胃,于灌胃后1、1.5、2、3、5、7、9、13 h頸動脈取血1mL。GC/MS和GC定性、定量檢測其中氯氮平含量。采用winNonlin藥代動力學(xué)軟件處理平均藥物濃度時間數(shù)據(jù),根據(jù)AIC信息判據(jù)選擇模型,計算毒物動力學(xué)參數(shù)。 3.動態(tài)分布:雄性wistar大鼠27只,經(jīng)灌胃勻速注入1/4LD50(65mg/kg)氯氮平,分別于給藥后1、2、3、3.5、4、4.5、5、6、8h處死大鼠,取心血、心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟、腦。心血加入肝素抗凝,4℃冰箱保存,其余臟器冷凍保存,樣品經(jīng)提取后進(jìn)行薄層色譜檢測。 4.死后分布:家兔6只,隨機(jī)分為兩組,分別LD50(270 mg/kg)、4LD50(1080 mg/kg)灌胃,死亡當(dāng)時,迅速解剖動物,取心血、心、肝、脾、肺、腎、腦等冷凍保存,堿性乙醚提取,GC/MS和GC定性定量檢測其中氯氮平含量。 5.死后再分布:Wistar大鼠,162只,雄性,隨機(jī)分為3組,隨機(jī)選擇2組1/2 LD50 (130 mg/kg)氯氮平灌胃,另一組治療量灌胃,2h達(dá)峰時立即處死。1/2 LD50灌胃的2組中隨機(jī)抽取一組去胃后,置于室溫(20?C)條件下,于死后0、2、4、8、12、24、48、72、96h取心血-20?C保存待檢。 家兔,48只,雄性,體重2000±500g,隨機(jī)分為兩組,其中一組結(jié)扎門靜脈,分別LD50(270 mg/kg)灌胃,2h達(dá)峰時立即處死,仰臥位置于室溫(20?C)條件下,于死后0、2、4、8、12、24、48、72h各組分別取3只家兔心血,-20℃冰箱保存待檢。解凍,液-液萃取血液,GC/MS和GC法定性、定量檢測氯氮平含量。 6.死后彌散:雄性家兔33只,隨機(jī)分為死后彌散組(15只)、溫度影響組(6只)、劑量影響組(6只)、灌胃時間影響組(6只)。 死后彌散組:將家兔固定于兔臺上,插胃管后,夾閉氣管處死;死后1h后,LD50(270mg/kg)氯氮平灌胃染毒,將染毒后家兔置于常溫環(huán)境下,分別于0.5d、1d、2d、4d、6d各解剖3只家兔,取心、肝、脾、肺、腎、腦、左下肢肌、右下肢肌、心血、周圍血、玻璃體液、尿、膽汁,置于-20℃冰箱內(nèi)保存待檢。 溫度影響組:將家兔固定于兔臺上,插胃管后,夾閉氣管處死;死后1h后,LD50(270 mg/kg)氯氮平灌胃染毒,將染毒后家兔(各3只)分別置于-20℃、4℃和常溫環(huán)境下,4d解剖動物,取心、肝、脾、肺、腎、腦、左下肢肌、右下肢肌、心血、周圍血、玻璃體液、尿、膽汁,置于-20℃冰箱內(nèi)保存待檢。 劑量影響組:將家兔固定于兔臺上,插胃管后,夾閉氣管處死;死后1h后,1/2 LD50與2 LD50氯氮平灌胃染毒,將染毒后家兔置于常溫環(huán)境下,4d解剖動物,取心、肝、脾、肺、腎、腦、左下肢肌、右下肢肌、心血、周圍血、玻璃體液、尿、膽汁,置于-20℃冰箱內(nèi)保存待檢。 灌胃時間影響組:將家兔固定于兔臺上,插胃管后,夾閉氣管處死;分別于死后3h和6h以LD50(270 mg/kg)氯氮平灌胃染毒,將染毒后家兔置于常溫環(huán)境下,4d解剖動物,取心、肝、脾、肺、腎、腦、左下肢肌、右下肢肌、心血、周圍血、玻璃體液、尿、膽汁,置于-20℃冰箱內(nèi)保存待檢。 7.保存檢材中分解動力學(xué):雄性犬6只,4LD50劑量(0.605g/kg)灌胃。灌胃后2h,經(jīng)股動脈插管采血,肝素抗凝;放血處死,取肝臟。每只犬血分四等份分別置于20℃、4℃、-20℃、20℃(加NaF至1%),每只犬肝分四等份分別置于20℃、4℃、-20℃、20℃(4%甲醛),分別于0、1、7、14、21、35、49、133d取材提取,GC/MS和GC法定性、定量檢測其中氯氮平含量。采用WinNonlin藥代動力學(xué)軟件處理平均藥物濃度,擬合分解動力學(xué)方程,計算分解半衰期。 8.用SPSS 13.0通用統(tǒng)計學(xué)軟件對實驗數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)處理,所有數(shù)據(jù)結(jié)果均用x±s表示,采用方差分析,LSD檢驗。 結(jié)果 1.氣相色譜/質(zhì)譜檢測:氣相色譜/質(zhì)譜分析氯氮平的特征離子為243,256。氣相色譜檢測,心血中氯氮平氣相色譜檢測的回歸方程Y = 33.396X + 0.9248(μg/mL)、線性檢測范圍(0.1 -48)μg/mL、相關(guān)系數(shù)0.985、回收率(92.40±1.0)%、最低檢出濃度0.1μg/mL。 2.氯氮平在家兔體內(nèi)的藥(毒)物代謝動力學(xué)過程呈一級動力學(xué)特征,符合一室開放模型。1/2 LD50劑量氯氮平的藥(毒)代動力學(xué)方程、平均吸收半衰期和平均消除半衰期為Ct = 3.397028(e - 2.57018t - e  0.27963t)、0.694433h和2.484292h。LD50劑量氯氮平的藥(毒)代動力學(xué)方程、平均吸收半衰期和平均消除半衰期為為Ct = 2.256018(e - 2.98751t - e  0.33022t)、1.529528h和3.798686h。 3. 1/4LD50劑量氯氮平在大鼠體內(nèi)的動態(tài)分布符合口服給藥一級動力學(xué)一室開放模型過程,各臟器中氯氮平的動態(tài)分布也符合血管外給藥一級動力學(xué)開放一室模型。心血中達(dá)峰時間和消除半衰期除為1.87h和4.91h;各臟器中達(dá)峰時間和消除半衰期為2.37~2.99 h和1.27~12.57h。在各組織臟器中的分布情況為心血、心、肝、腦氯氮平含量高,脾、肺、腎中氯氮平含量隨時間先升高后降低。 4.死后分布:死亡當(dāng)時家兔各臟器組織氯氮平含量由高到低分別為(t檢驗,P0.05):①LD50組:肺(108.63±39.55)肝(46.38±9.59)、腦(44.79±38.57)、脾(24.56±3.74)、腎(24.14±2.39)膽汁(9.85±1.96)、心(9.70±4.40)、心血(5.95±0.72)、尿(5.02±0.57)、玻璃體液(4.92±0.55)下肢肌(4.00±1.28);②4LD50組:肺(273.16±131.24)、肝(269.03±120.75)腦(178.81±144.44)、脾(103.02±23.48)、腎(96.19±67.38)膽汁(36.53±25.92)、心(24.48±8.84)、下肢肌(11.57±7.89)、心血(10.26±2.91)、玻璃體液(7.85±4.84)尿(5.35±0.88)。 5.死后再分布:染毒大鼠1/2 LD50去胃組在處死后24h氯氮平濃度顯著升高(P0.05),此時心血濃度與死亡當(dāng)時心血濃度之比(C24h /C0h)達(dá)4.32;1/2 LD50非去胃組在處死后8-24h氯氮平濃度顯著升高(P0.05),此時心血濃度與死亡當(dāng)時心血濃度之比(C8-24h /C0h)達(dá)1.69-3.06;治療量組在處死后2-48h氯氮平濃度顯著升高(P0.05),此時心血濃度與死亡當(dāng)時心血濃度之比(C8-24h /C0h)達(dá)1.86-3.15。 染毒家兔結(jié)扎門靜脈組在處死后4-48h氯氮平濃度發(fā)生降低(P0.05),此時心血濃度與死亡當(dāng)時心血濃度之比(C4-48h /C0h)達(dá)0.69-0.78。 6.死后彌散:家兔處死后1小時LD50氯氮平灌胃染毒,室溫下心、肝、肺、腎、左下肢、右下肢、心血在12h可以檢測出氯氮平,腦,膽汁在2d開始檢出氯氮平;尿中始終未檢出氯氮平。常溫、4度、-20度條件下左下肢肌、右下肢肌、尿、玻璃體液均未檢出氯氮平,-20度時心血、外周血、膽汁、心、腎、腦均未檢出氯氮平,肝臟中氯氮平的濃度隨著保存溫度的降低而降低,且具有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。1/2 LD50、LD50、2LD50三種劑量下右下肢肌、尿、膽汁中未檢出氯氮平,隨著給藥劑量增大,心、右下肢肌、玻璃體液中氯氮平濃度增大(P0.05)。在死后1h、3h、6h三種灌胃時間條件下,左下肢肌、右下肢肌、尿、玻璃體液中均未檢出氯氮平,在死后6h灌藥,心、腎、膽汁中未檢出氯氮平。 7.分解動力學(xué):不同條件保存血和肝中氯氮平含量均呈下降趨勢,氯氮平在血和肝中的分解動力學(xué)呈一級動力學(xué)特征,符合一室開放模型。20℃、4℃、-20℃、20℃(加NaF至1%)保存至7d、21d、35d、49d,犬血中氯氮平濃度分別顯著下降至最初濃度的28.93%、16.11%、14.06%、0.11%;78.48%、55.14%、53.44%、34.02%;66.27%、38.85%、31.04%、17.70%;91.49%、88.49%、74.07%、68.90%。保存133 d時犬血中氯氮平濃度分別顯者下降至最初濃度的0.10%、12.14%、19.28%、62.20%,其分解半衰期分別為:8.31d、19.90d、35.49d、171.16d。20℃、4℃、-20℃、20℃(10%甲醛)保存至7d、21d、35d、49d時犬肝中氯氮平濃度分別顯者下降至最初濃度的62.93%、59.88%、50.69%、45.83%;70.73%、75.39%、45.96%、44.67%;77.27%、74.72%、67.97%、58.59%;28.78%、27.95%、23.03%、13.98%。保存133 d時犬肝中氯氮平濃度分別顯者下降至最初濃度的43.51%、41.27%、50.19%、10.90%,其分解半衰期分別為:79.40d、82.35d、100.89d、8.88d。 結(jié)論 1.本文建立了生物檢材中氯氮平氣相色譜/質(zhì)譜檢測方法,選擇性好,定性準(zhǔn)確,氣相色譜檢測簡便,快速,靈敏,定量結(jié)果準(zhǔn)確,可應(yīng)用于氯氮平中毒的臨床快速檢驗診斷和中毒(死)案件的法醫(yī)學(xué)鑒定;建立了氯氮平的毒物動力學(xué)、死后分布、死后再分布、死后彌散、分解動力學(xué)研究動物模型,可應(yīng)用于氯氮平的法醫(yī)毒物動力學(xué)研究。 2.氯氮平在家兔體內(nèi)的毒物動力學(xué)呈一級動力學(xué)過程,符合一室開放模型。染毒劑量增大,其吸收半衰期和消除半衰期均延長大,染毒劑量對氯氮平的代謝動力學(xué)有影響。 3.氯氮平在大鼠體內(nèi)動態(tài)分布符合口服給藥一級動力學(xué)一室開放模型,各臟器與血液的C-T曲線大致相似,臟器濃度與血液濃度具有一致的動態(tài)變化,吸收半衰期無顯著性差異;但是心血、心臟、肝臟與其他臟器的消除半衰期具有顯著性差異。說明氯氮平進(jìn)入體內(nèi)后,能迅速向各組織器官分布,并達(dá)到動態(tài)平衡。 4.4LD50劑量染毒家兔體內(nèi)氯氮平含量以肝臟、脾臟、肺臟、腎臟、腦居多;LD50劑量染毒家兔體內(nèi)氯氮平以肝臟、脾臟、肺臟、腎臟、腦居多,由此可見不同劑量對氯氮平的死后分布沒有影響。 5.死后再分布:染毒大鼠1/2 LD50非去胃組8-24h發(fā)生死后再分布,而1/2 LD50去胃組在24h發(fā)生死后再分布,后者發(fā)生死后再分布的時間延遲原因可能為摘除胃,使得藥物蓄積庫不存在引起的;治療量組在2-48h發(fā)生死后再分布;說明劑量對死后再分布有影響。門靜脈結(jié)扎家兔組心血中氯氮平濃度降低,原因可能為門靜脈被結(jié)扎,阻止了死后血液流動。綜上可見,去胃和門靜脈結(jié)扎均影響到死后再分布,說明了蓄積庫順濃度梯度擴(kuò)散是與死后血液流動是發(fā)生死后再分布的機(jī)制。同時門靜脈結(jié)扎也驗證了死后血液流動的存在。 6.死后彌散:脾、肺、心、肝、腎受死后彌散影響較大,左下肢肌、右下肢肌、玻璃體液、心血、外周血、腦,膽汁受到死后彌散的影響較小,尿液中無影響。溫度、灌胃時間對氯氮平死后彌散有影響,灌藥劑量對死后彌散影響較小。氯氮平在各臟器中死后彌散不均勻,這可能與藥物本身的性質(zhì)、臟器的血流量、漿蛋白結(jié)合率以及與胃的距離遠(yuǎn)近等許多影響因素有關(guān)。 7.在20℃、4℃、-20℃、20℃(加NaF至1%)保存條件下,血中氯氮平均呈現(xiàn)下降趨勢,可見在NaF添加組中血中氯氮平的降解最慢(P0.05),其次隨著溫度降低氯氮平的降解明顯減慢;在20℃、4℃、-20℃、20℃(10%甲醛)保存條件下,肝臟中氯氮平均呈現(xiàn)下降趨勢,其分解半衰期分別為:79.40d、82.35d、100.89d、8.88d,可見在甲醛添加組中肝臟中氯氮平的降解最快(P0.05),其次隨著溫度降低氯氮平的降解明顯減慢。說明溫度可以影響保存檢材中氯氮平的降解,在血中添加NaF可以延緩氯氮平的降解,甲醛保存肝臟會加速氯氮平的降解。實際工作中應(yīng)該注意檢材的送檢時間和檢材的保存條件。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：山西醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2011
【分類號】：D919.1

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本文編號：2354051