本文關鍵詞：大鼠心肌組織中microRNA和18S rRNA的含量變化與死亡時間的相關性研究　出處：《復旦大學》2011年碩士論文　論文類型：學位論文

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【摘要】：死亡時間(postmortem interval PMI),又稱死后間隔時間,是指發(fā)現(xiàn)、檢查尸體時距死亡發(fā)生時的時間間隔。死亡時間的準確推斷,具有重要的法醫(yī)學實踐價值,一直是法醫(yī)學研究中的一個重點和難點。 死亡時間的推斷有多種方法,傳統(tǒng)主要是依據(jù)尸體現(xiàn)象(尸斑、尸冷、尸僵等)和胃內(nèi)容物消化過程、尸體蠅蛆生長規(guī)律等,但這些方法比較粗略,并且受環(huán)境、地域的影響比較大。近年來隨著分子生物學技術的發(fā)展,生物體內(nèi)核酸物質(zhì)在機體死后的時間依賴性降解規(guī)律逐漸被應用于死亡時間推斷的研究。 眾多學者發(fā)現(xiàn)管家基因的降解變化與死亡時間之間存在良好的線性關系,適合用于死亡時間的推斷研究。目前的研究集中在GAPDH和β-actin,但由于GAPDH和β-actin屬于機體內(nèi)高豐度mRNA,在早期死亡時間內(nèi)變化曲線并不明顯,更適合作內(nèi)參。同時mRNA的降解也受環(huán)境因素的影響,這也是限制其應用于死亡時間推斷研究的一個因素。我們通過前期實驗研究發(fā)現(xiàn)微小RNA (microRNA)和18S核糖體RNA,在大鼠死亡后的不同階段具有較好的穩(wěn)定性和變化規(guī)律,更適合用于死亡時間的推斷。 本課題通過實驗篩選出大鼠心肌細胞中受環(huán)境因素影響較小同時在機體死后具有一定降解規(guī)律的核酸物質(zhì),如miRNA和18S rRNA。固定外界環(huán)境溫度及濕度,以大鼠心肌組織為研究對象,應用實時熒光定量PCR評價miRNA和18S rRNA在機體死后不同時間的變化規(guī)律,旨在為死亡時間推斷研究提供新的手段及指標。 第一部分大鼠死后不同死亡時間組織提取及心肌形態(tài)學鑒定 目的獲得大鼠死后不同時間的心肌組織,并觀察不同死亡時間心肌形態(tài)學變化。 方法固定外界環(huán)境溫度及濕度,斷頸處死大鼠,于死后不同時間解剖取心肌組織。福爾馬林固定后切片進行HE染色。 結果成功獲得了大鼠死后不同時間的心肌組織。心肌HE染色結果顯示,心肌自溶變化規(guī)律與傳統(tǒng)尸體現(xiàn)象發(fā)生規(guī)律基本一致。24h開始有少量心肌細胞發(fā)生自溶,細胞破裂；96h大部分細胞發(fā)生自溶,細胞結構不清,核消失；144h后,橫紋肌完全消失,心肌細胞核完全崩解、碎裂；168h后,無細胞形態(tài),無細胞核。 第二部分大鼠死后不同死亡時間組織RNA的提取及降解規(guī)律分析 目的研究組織RNA的降解變化規(guī)律與死亡時間的相互關系。 方法Trizol提取組織RNA, Nano Drop1000檢測RNA抽提的濃度及純度。非變性凝膠電泳觀察不同死亡時間RNA的降解變化規(guī)律。 結果28S條帶隨著死亡時間的延長呈現(xiàn)逐漸降解的趨勢,至24h基本消失,5S條帶變化不明顯。48h后,RNA基本被降解為小片段。 第三部分大鼠死后心肌組織中microRNA和18S rRNA的熒光定量分析 目的研究大鼠心肌組織中microRNA和18S rRNA的變化規(guī)律與死亡時間的相互關系。 方法實時熒光定量聚合酶鏈式反應法檢測大鼠心肌細胞中microRNA和18S rRNA的含量水平。 結果大鼠死后120h內(nèi)心肌組織中miRNA(如miR-1-2)含量無明顯變化,此后開始下降；而18S rRNA含量在96h內(nèi)逐漸增多,隨后開始緩慢下降。大鼠死后不同時間18S rRNA的Ct值以及18S rRNA和miR-1-2的ΔCt值與PMI呈非線性相關,回歸方程分別為：Y1=0.0012X2-0.1759X+19.022(R2=0.9487)；Y2=-0.0006X2+0.1192X-0.1833(R2=0.8072)。 第四部分已知死亡時間人體組織樣本的初步實驗驗證分析 目的初步驗證已知確切死亡時間的人體心肌組織中microRNA和18S rRNA的含量水平與動物實驗所得回歸方程的契合度。 方法實時熒光定量聚合酶鏈式反應法檢測人體心肌細胞中microRNA和18S rRNA的含量水平,將結果代入回歸方程比較推測值與實際值間的誤差。 結果人體心肌組織中microRNA和18S rRNA的含量較大鼠心肌組織豐富,根據(jù)回歸方程推斷的死亡時間與實際死亡時間基本吻合,誤差在2小時左右。 結論 利用mRNA尤其是管家基因(如GAPDH和β-actin)的降解規(guī)律推斷死亡時間是現(xiàn)階段法醫(yī)學研究的焦點。但是,由于如GAPDH和β-actin屬于高豐度mRNA,在早期死亡時間內(nèi)變化規(guī)律不明顯,更適合在推斷死亡時間時作為內(nèi)參照。選擇一個或多個指標綜合判斷PMI是突破傳統(tǒng)死亡時間推斷研究的關鍵。本實驗研究發(fā)現(xiàn)miRNA和18SrRNA具有良好的穩(wěn)定性和規(guī)律性,在法醫(yī)學死亡時間推斷中具有良好的應用價值。 本實驗采用ABI 7500 Fast Real-Time PCR儀進行相關研究,發(fā)現(xiàn)miRNA相對穩(wěn)定。在機體死后120h內(nèi)miRNA的含量保持在一個相對穩(wěn)定的水平,不隨死亡時間的變化而發(fā)生變化,在120h后它的含量開始下降。這是因為microRNA是一類非編碼的單鏈小RNA,只有21～25個核苷酸,由于片段很小,在生物體內(nèi)非常穩(wěn)定。說明在早期死亡時間內(nèi),miRNA可以作為一個穩(wěn)定的內(nèi)參照指標客觀反映其它生物指標的變化水平。因此,miRNA作為一種分子標志物由于其穩(wěn)定性在死亡時間推斷中具有非常重要的價值。 本研究同時發(fā)現(xiàn)18S rRNA大鼠死亡后早期階段含量逐漸增多,在96h左右達到峰值,隨后又開始下降。分析認為18S rRNA在細胞中以單獨形式存在的含量很少,大部分存在于由多個核糖體組成的復雜核糖體蛋白復合物中。這為18S rRNA提供了一個相對安全的環(huán)境,可以隔絕RNA酶和其他化學因素的影響,使18S rRNA保持穩(wěn)定。隨著死亡時間的延長,蛋白質(zhì)降解,18S rRNA從復合物中釋放出來,在死后一定時間內(nèi),含量逐漸增多,具有一定的規(guī)律性。這是由于在死后的96h內(nèi),18S rRNA的降解速度低于其從核糖體蛋白復合物中釋放的速度；而96h之后,由于大部分18S rRNA已經(jīng)釋放,其降解速度開始超過釋放速度,使96h之后的18S rRNA含量逐漸下降。 本課題組認為,綜合利用miRNA的穩(wěn)定性和18S核糖體RNA的規(guī)律性進行死亡時間推斷,比單獨利用管家基因的半定量PCR的結果更加準確、可靠。由于尸體現(xiàn)象的發(fā)生和發(fā)展受到各種條件的制約,不管是利用DNA、RNA或是蛋白質(zhì)的降解規(guī)律進行死亡時間推斷都存在一定的缺陷和不足,一種指標和方法難以準確判斷死亡時間。如何選擇、優(yōu)化不同指標并將這幾種指標和方法進行綜合應用,是今后利用生物大分子推斷死亡時間的研究方向。 本實驗通過更為精確的Real-Time PCR方法發(fā)現(xiàn)18S rRNA的變化規(guī)律與死亡時間存在密切關系(Y=0.0012X2-0.1759X+19.022),miRNA在死后較長的時間內(nèi)含量保持穩(wěn)定。通過收集已知死亡時間的人體組織樣本,進行初步實驗驗證分析后,得出的結果與實際死亡時間存在一定的誤差,但誤差在2h左右,證明microRNA和18S rRNA的變化規(guī)律能較為準確的進行死亡時間判斷。
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【學位授予單位】：復旦大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2011
【分類號】：D919

【參考文獻】

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本文編號：1384159