本文關(guān)鍵詞：大鼠心肌組織中microRNA和18S rRNA的含量變化與死亡時(shí)間的相關(guān)性研究　出處：《復(fù)旦大學(xué)》2011年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

  更多相關(guān)文章： 法醫(yī)病理學(xué) 死亡時(shí)間 microRNA 18S rRNA 聚合酶鏈反應(yīng) 核糖體

【摘要】：死亡時(shí)間(postmortem interval PMI),又稱死后間隔時(shí)間,是指發(fā)現(xiàn)、檢查尸體時(shí)距死亡發(fā)生時(shí)的時(shí)間間隔。死亡時(shí)間的準(zhǔn)確推斷,具有重要的法醫(yī)學(xué)實(shí)踐價(jià)值,一直是法醫(yī)學(xué)研究中的一個(gè)重點(diǎn)和難點(diǎn)。 死亡時(shí)間的推斷有多種方法,傳統(tǒng)主要是依據(jù)尸體現(xiàn)象(尸斑、尸冷、尸僵等)和胃內(nèi)容物消化過程、尸體蠅蛆生長規(guī)律等,但這些方法比較粗略,并且受環(huán)境、地域的影響比較大。近年來隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展,生物體內(nèi)核酸物質(zhì)在機(jī)體死后的時(shí)間依賴性降解規(guī)律逐漸被應(yīng)用于死亡時(shí)間推斷的研究。 眾多學(xué)者發(fā)現(xiàn)管家基因的降解變化與死亡時(shí)間之間存在良好的線性關(guān)系,適合用于死亡時(shí)間的推斷研究。目前的研究集中在GAPDH和β-actin,但由于GAPDH和β-actin屬于機(jī)體內(nèi)高豐度mRNA,在早期死亡時(shí)間內(nèi)變化曲線并不明顯,更適合作內(nèi)參。同時(shí)mRNA的降解也受環(huán)境因素的影響,這也是限制其應(yīng)用于死亡時(shí)間推斷研究的一個(gè)因素。我們通過前期實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)微小RNA (microRNA)和18S核糖體RNA,在大鼠死亡后的不同階段具有較好的穩(wěn)定性和變化規(guī)律,更適合用于死亡時(shí)間的推斷。 本課題通過實(shí)驗(yàn)篩選出大鼠心肌細(xì)胞中受環(huán)境因素影響較小同時(shí)在機(jī)體死后具有一定降解規(guī)律的核酸物質(zhì),如miRNA和18S rRNA。固定外界環(huán)境溫度及濕度,以大鼠心肌組織為研究對象,應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR評價(jià)miRNA和18S rRNA在機(jī)體死后不同時(shí)間的變化規(guī)律,旨在為死亡時(shí)間推斷研究提供新的手段及指標(biāo)。 第一部分大鼠死后不同死亡時(shí)間組織提取及心肌形態(tài)學(xué)鑒定 目的獲得大鼠死后不同時(shí)間的心肌組織,并觀察不同死亡時(shí)間心肌形態(tài)學(xué)變化。 方法固定外界環(huán)境溫度及濕度,斷頸處死大鼠,于死后不同時(shí)間解剖取心肌組織。福爾馬林固定后切片進(jìn)行HE染色。 結(jié)果成功獲得了大鼠死后不同時(shí)間的心肌組織。心肌HE染色結(jié)果顯示,心肌自溶變化規(guī)律與傳統(tǒng)尸體現(xiàn)象發(fā)生規(guī)律基本一致。24h開始有少量心肌細(xì)胞發(fā)生自溶,細(xì)胞破裂；96h大部分細(xì)胞發(fā)生自溶,細(xì)胞結(jié)構(gòu)不清,核消失；144h后,橫紋肌完全消失,心肌細(xì)胞核完全崩解、碎裂；168h后,無細(xì)胞形態(tài),無細(xì)胞核。 第二部分大鼠死后不同死亡時(shí)間組織RNA的提取及降解規(guī)律分析 目的研究組織RNA的降解變化規(guī)律與死亡時(shí)間的相互關(guān)系。 方法Trizol提取組織RNA, Nano Drop1000檢測RNA抽提的濃度及純度。非變性凝膠電泳觀察不同死亡時(shí)間RNA的降解變化規(guī)律。 結(jié)果28S條帶隨著死亡時(shí)間的延長呈現(xiàn)逐漸降解的趨勢,至24h基本消失,5S條帶變化不明顯。48h后,RNA基本被降解為小片段。 第三部分大鼠死后心肌組織中microRNA和18S rRNA的熒光定量分析 目的研究大鼠心肌組織中microRNA和18S rRNA的變化規(guī)律與死亡時(shí)間的相互關(guān)系。 方法實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)法檢測大鼠心肌細(xì)胞中microRNA和18S rRNA的含量水平。 結(jié)果大鼠死后120h內(nèi)心肌組織中miRNA(如miR-1-2)含量無明顯變化,此后開始下降；而18S rRNA含量在96h內(nèi)逐漸增多,隨后開始緩慢下降。大鼠死后不同時(shí)間18S rRNA的Ct值以及18S rRNA和miR-1-2的ΔCt值與PMI呈非線性相關(guān),回歸方程分別為：Y1=0.0012X2-0.1759X+19.022(R2=0.9487)；Y2=-0.0006X2+0.1192X-0.1833(R2=0.8072)。 第四部分已知死亡時(shí)間人體組織樣本的初步實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證分析 目的初步驗(yàn)證已知確切死亡時(shí)間的人體心肌組織中microRNA和18S rRNA的含量水平與動物實(shí)驗(yàn)所得回歸方程的契合度。 方法實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)法檢測人體心肌細(xì)胞中microRNA和18S rRNA的含量水平,將結(jié)果代入回歸方程比較推測值與實(shí)際值間的誤差。 結(jié)果人體心肌組織中microRNA和18S rRNA的含量較大鼠心肌組織豐富,根據(jù)回歸方程推斷的死亡時(shí)間與實(shí)際死亡時(shí)間基本吻合,誤差在2小時(shí)左右。 結(jié)論 利用mRNA尤其是管家基因(如GAPDH和β-actin)的降解規(guī)律推斷死亡時(shí)間是現(xiàn)階段法醫(yī)學(xué)研究的焦點(diǎn)。但是,由于如GAPDH和β-actin屬于高豐度mRNA,在早期死亡時(shí)間內(nèi)變化規(guī)律不明顯,更適合在推斷死亡時(shí)間時(shí)作為內(nèi)參照。選擇一個(gè)或多個(gè)指標(biāo)綜合判斷PMI是突破傳統(tǒng)死亡時(shí)間推斷研究的關(guān)鍵。本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)miRNA和18SrRNA具有良好的穩(wěn)定性和規(guī)律性,在法醫(yī)學(xué)死亡時(shí)間推斷中具有良好的應(yīng)用價(jià)值。 本實(shí)驗(yàn)采用ABI 7500 Fast Real-Time PCR儀進(jìn)行相關(guān)研究,發(fā)現(xiàn)miRNA相對穩(wěn)定。在機(jī)體死后120h內(nèi)miRNA的含量保持在一個(gè)相對穩(wěn)定的水平,不隨死亡時(shí)間的變化而發(fā)生變化,在120h后它的含量開始下降。這是因?yàn)閙icroRNA是一類非編碼的單鏈小RNA,只有21～25個(gè)核苷酸,由于片段很小,在生物體內(nèi)非常穩(wěn)定。說明在早期死亡時(shí)間內(nèi),miRNA可以作為一個(gè)穩(wěn)定的內(nèi)參照指標(biāo)客觀反映其它生物指標(biāo)的變化水平。因此,miRNA作為一種分子標(biāo)志物由于其穩(wěn)定性在死亡時(shí)間推斷中具有非常重要的價(jià)值。 本研究同時(shí)發(fā)現(xiàn)18S rRNA大鼠死亡后早期階段含量逐漸增多,在96h左右達(dá)到峰值,隨后又開始下降。分析認(rèn)為18S rRNA在細(xì)胞中以單獨(dú)形式存在的含量很少,大部分存在于由多個(gè)核糖體組成的復(fù)雜核糖體蛋白復(fù)合物中。這為18S rRNA提供了一個(gè)相對安全的環(huán)境,可以隔絕RNA酶和其他化學(xué)因素的影響,使18S rRNA保持穩(wěn)定。隨著死亡時(shí)間的延長,蛋白質(zhì)降解,18S rRNA從復(fù)合物中釋放出來,在死后一定時(shí)間內(nèi),含量逐漸增多,具有一定的規(guī)律性。這是由于在死后的96h內(nèi),18S rRNA的降解速度低于其從核糖體蛋白復(fù)合物中釋放的速度；而96h之后,由于大部分18S rRNA已經(jīng)釋放,其降解速度開始超過釋放速度,使96h之后的18S rRNA含量逐漸下降。 本課題組認(rèn)為,綜合利用miRNA的穩(wěn)定性和18S核糖體RNA的規(guī)律性進(jìn)行死亡時(shí)間推斷,比單獨(dú)利用管家基因的半定量PCR的結(jié)果更加準(zhǔn)確、可靠。由于尸體現(xiàn)象的發(fā)生和發(fā)展受到各種條件的制約,不管是利用DNA、RNA或是蛋白質(zhì)的降解規(guī)律進(jìn)行死亡時(shí)間推斷都存在一定的缺陷和不足,一種指標(biāo)和方法難以準(zhǔn)確判斷死亡時(shí)間。如何選擇、優(yōu)化不同指標(biāo)并將這幾種指標(biāo)和方法進(jìn)行綜合應(yīng)用,是今后利用生物大分子推斷死亡時(shí)間的研究方向。 本實(shí)驗(yàn)通過更為精確的Real-Time PCR方法發(fā)現(xiàn)18S rRNA的變化規(guī)律與死亡時(shí)間存在密切關(guān)系(Y=0.0012X2-0.1759X+19.022),miRNA在死后較長的時(shí)間內(nèi)含量保持穩(wěn)定。通過收集已知死亡時(shí)間的人體組織樣本,進(jìn)行初步實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證分析后,得出的結(jié)果與實(shí)際死亡時(shí)間存在一定的誤差,但誤差在2h左右,證明microRNA和18S rRNA的變化規(guī)律能較為準(zhǔn)確的進(jìn)行死亡時(shí)間判斷。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：復(fù)旦大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2011
【分類號】：D919

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 劉良,張力,劉亞玲,鄧偉年,饒廣勛,林樂泉,劉艷;大鼠腦細(xì)胞DNA含量與死亡時(shí)間關(guān)系的圖像分析[J];中國法醫(yī)學(xué)雜志;2000年01期

2 呂江明,余家樹,陳民敬,向吉夫,慈日東;大鼠死后心肌骨骼肌細(xì)胞肌動蛋白變化及與死亡時(shí)間的關(guān)系[J];中國法醫(yī)學(xué)雜志;2004年04期

3 肖俊輝,陳玉川;死后不同時(shí)間大鼠心肌膈肌β肌動蛋白mRNA的檢測[J];中國法醫(yī)學(xué)雜志;2005年04期

4 何遠(yuǎn);閆平;胡家偉;孟曉萍;;單細(xì)胞凝膠電泳檢測大鼠死后肝細(xì)胞核DNA降解[J];中國法醫(yī)學(xué)雜志;2005年06期

5 鄭旭東;張益鵠;支獻(xiàn)民;張勝力;郭克民;葛秀峰;張書紅;;免疫印跡檢測人胸大肌肌鈣蛋白I推斷較晚期死后經(jīng)過時(shí)間[J];中國法醫(yī)學(xué)雜志;2006年03期

6 劉季;宋貞柱;謝潤紅;任廣睦;王英元;;大鼠死后腦組織RNA降解與死亡時(shí)間推斷的研究[J];中國法醫(yī)學(xué)雜志;2007年04期

7 蒯錦霞;劉楊;張彥偉;王英元;;大鼠死后心肌和肺臟微管蛋白降解規(guī)律的初探研究[J];中國法醫(yī)學(xué)雜志;2008年02期

8 任廣睦;尉潔;劉季;王英元;;死亡大鼠看家基因mRNA時(shí)序性降解的組織差異性研究[J];中國法醫(yī)學(xué)雜志;2009年03期

9 陳玉川,成建定;離體人胸骨骨髓DNA降解與腐敗尸體死亡時(shí)間推斷的初步研究[J];法醫(yī)學(xué)雜志;2002年03期

10 肖俊輝,陳玉川,王江峰,高翠蓮,劉水平,成建定;根據(jù)mRNA穩(wěn)定性推斷死亡時(shí)間的研究[J];法醫(yī)學(xué)雜志;2005年01期

，

本文編號：1384159