本文關(guān)鍵詞：百草枯檢測(cè)新方法及百草枯在小鼠體內(nèi)死后再分布和死后彌散研究　出處：《河北醫(yī)科大學(xué)》2013年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

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【摘要】：百草枯又名克蕪蹤、對(duì)草快，化學(xué)名是1,1-二甲基-4,4聯(lián)吡啶陽(yáng)離子鹽，分子式為C_(12)H_(14)N_2·2Cl，分子量為257.2Da，是目前全世界廣泛使用的有機(jī)雜環(huán)類接觸性脫葉劑，具有觸殺作用和一定內(nèi)吸作用。純品為白色結(jié)晶，以陽(yáng)離子形式存在，易溶于水，微溶于乙醇和丙酮，在酸中穩(wěn)定存在，，在堿中易被分解，常用制劑為20%的水溶液�？诜卸舅劳雎士蛇_(dá)90%以上，目前已被20多個(gè)國(guó)家禁止或者嚴(yán)格限制使用。 百草枯對(duì)哺乳動(dòng)物具有較強(qiáng)的毒性，尤其是人。目前也沒有特效藥可以解毒，口服中毒死亡率可達(dá)90%以上。據(jù)報(bào)道，每年在亞洲、美洲、歐洲都有大量的百草枯死亡案例出現(xiàn)，已報(bào)告的死亡病例達(dá)數(shù)百例，多是經(jīng)口誤服致死。 百草枯可通過消化道、受損的皮膚等途徑進(jìn)人體，中毒后死亡率高，尤其以肺部最為突出，此外還對(duì)全身其他臟器造成嚴(yán)重?fù)p傷。大腦作為神經(jīng)中樞部位，對(duì)毒物反應(yīng)極為敏感。百草枯對(duì)哺乳動(dòng)物腦組織中單胺類神經(jīng)遞質(zhì)存在的危害，為探討其神經(jīng)毒性提供了試驗(yàn)素材。 百草枯可以引起多臟器的損傷，尤其是肺部最為明顯。肺部損傷主要表現(xiàn)形式為肺水腫、肺泡出血、炎癥細(xì)胞侵潤(rùn)、膠原沉積和成纖維細(xì)胞增生等。早期患者在中毒幾天內(nèi)死于急性呼吸窘迫綜合征和多臟器功能的衰竭。即使早期存活的患者也會(huì)因肺間質(zhì)纖維化在數(shù)周內(nèi)死亡，個(gè)別幸存病人也由于肺間質(zhì)的纖維化其生存質(zhì)量嚴(yán)重下降。 基于上述原因，本實(shí)驗(yàn)研究首先建立了兩種檢測(cè)百草枯的新方法，又將小鼠作為動(dòng)物模型，研究了百草枯在其體內(nèi)的死后分布、死后再分布和死后彌散現(xiàn)象，觀察了中毒小鼠血液及腦中單胺類神經(jīng)遞質(zhì)的變化情況。第一部分除草劑百草枯測(cè)定方法的建立 （1）毛細(xì)管電泳—紫外檢測(cè)法測(cè)定血清中百草枯方法的建立 目的：建立一種準(zhǔn)確、簡(jiǎn)便、快速的方法用于測(cè)定百草枯的含量。 方法：將商品除草劑直接稀釋后上樣；血清中的百草枯則需要C_(18)固相萃取后上樣，在256nm紫外波長(zhǎng)處測(cè)定百草枯的含量。毛細(xì)管電泳法采用重力進(jìn)樣，進(jìn)樣高度25cm，進(jìn)樣時(shí)間15s，彈性石英毛細(xì)管內(nèi)徑75μm，有效分離長(zhǎng)度55cm，分離電壓12kV，以濃度20mmol/L，pH3.5的NaH_2PO_4緩沖溶液，1.0mmol/L的十二烷基硫酸鈉（SDS）作為電泳緩沖液進(jìn)行分離。 結(jié)果：毛細(xì)管電泳—紫外檢測(cè)法測(cè)得百草枯線性范圍為0.02~5.00μg/ml，線性回歸方程A=36977c-517，相關(guān)系數(shù)0.9984。平行進(jìn)樣7次，其RSD為4.52%，計(jì)算所得百草枯的檢出限為3.0ng/ml。測(cè)得除草劑中百草枯的實(shí)際含量是182.1g/L。將百草枯實(shí)際樣品稀釋2×105倍過濾后，加入0.02，1.00，2.50μg/ml的標(biāo)準(zhǔn)品測(cè)得PQ的回收率分別為96.7%，90.1%，95.6%，平均回收率為94.1%，平均RSD為2.17%。向血清中分別加入上述PQ的標(biāo)準(zhǔn)品固相萃取后，測(cè)得其回收率分別為85.0%，88.0%，82.0%，平均回收率為85.0%，平均RSD為4.79%。 小結(jié)：毛細(xì)管電泳紫外檢測(cè)法測(cè)定除草劑中百草枯的含量方法準(zhǔn)確可靠，結(jié)果令人滿意。 （2）修飾電極—電化學(xué)法測(cè)定除草劑中百草枯的含量 目的：研究百草枯在番紅花紅/金納米/DNA修飾的玻碳電極的電化學(xué)行為,并用于實(shí)際樣品的測(cè)定，從而建立一種準(zhǔn)確、簡(jiǎn)便、快速的方法用于測(cè)定百草枯的含量。 方法：（1）修飾電極的制備：將裸玻碳電極置于Al2O3粉末的懸漿之中進(jìn)行打磨至鏡面，取出，依次用1：1的丙酮、1：1的硝酸、二次蒸餾水，各超聲清洗5分鐘，氮?dú)獯蹈�。�?）條件選擇：找出SFR聚合最佳濃度、SFR最佳聚合圈數(shù)、金納米浸泡最佳時(shí)間、DNA浸泡最佳時(shí)間和緩沖液最佳pH值。（3）在最佳條件下，利用差分脈沖法測(cè)定不同濃度百草枯在修飾電極上的線性關(guān)系。（4）在2×10-4mol/L百草枯溶液中，考察修飾膜的穩(wěn)定性及干擾物對(duì)其測(cè)定時(shí)的影響。（5）利用SFR/Au/DNA聚合膜電極對(duì)百草枯樣品進(jìn)行了測(cè)定，將其稀釋至所在范圍濃度，在最佳條件下用差分脈沖法進(jìn)行測(cè)定。 結(jié)果：（1）條件選擇：SFR的最佳濃度為2mmol/L；SFR的最佳聚合圈數(shù)為30圈；金納米修飾時(shí)間為8h；DNA修飾時(shí)間為4h；緩沖溶液最佳pH為7.0；（2）利用修飾電極，電化學(xué)檢測(cè)法測(cè)得百草枯線性范圍為1.0×10~(-5)~1.0×10~(-3)mol/L，線性回歸方程H=5.5921c+0.2537，相關(guān)系數(shù)R~2=0.9957。平行測(cè)定11次，其RSD為5.84%，計(jì)算所得百草枯的檢出限為3.3×10~(-6)mol/L。測(cè)得除草劑中百草枯的實(shí)際含量是183.6g/L。將百草枯實(shí)際樣品稀釋后，加入0.05，0.25，0.50mmol/L的標(biāo)準(zhǔn)品測(cè)得PQ的回收率分別為100.0%，97.4%，97.4%，平均回收率為98.3%；平均RSD為4.70%。 小結(jié)：發(fā)現(xiàn)SFR/Au/DNA聚合膜對(duì)于百草枯的還原能夠起到明顯的電催化作用，該電極已用于實(shí)際樣品測(cè)定，結(jié)果令人滿意。 第二部分百草枯在小鼠體內(nèi)的死后分布、死后再分布及死后彌散研究 目的：（1）建立小鼠百草枯死后分布、埋葬尸體中的分解動(dòng)力學(xué)及死后百草枯灌胃死后彌散的動(dòng)物模型；（2）研究百草枯在小鼠體內(nèi)的死后分布及埋葬尸體中的分解動(dòng)力學(xué)；（3）研究百草枯在小鼠體內(nèi)的死后彌散現(xiàn)象。 方法：（1）百草枯在埋葬尸體中的分解動(dòng)力學(xué)研究 ①取健康昆明小鼠28只，8LD_(50)劑量百草枯灌胃染毒致死。0天的死后立即解剖取材，其余裝入塑料袋，不封口，埋于河北醫(yī)科大學(xué)本部公共衛(wèi)生學(xué)院西面花園中。分別于21、42、63、84、105、126天后挖出，解剖取材，高效液相色譜法檢測(cè)其中百草枯的含量；②取健康昆明小鼠8只，8LD_(50)劑量百草枯灌胃染毒致死，死后隨機(jī)分成2組，分別裝于木箱和編織袋中，埋于花園中，63天后挖出解剖取材，檢測(cè)其中百草枯的含量；③取健康昆明小鼠8只，以同樣劑量處死后，分別于2012.3.3與2012.5.5埋葬，63天后（即2012.5.5及2012.7.7）挖出；解剖取材，檢測(cè)百草枯的含量。 （2）百草枯在小鼠體內(nèi)的死后彌散研究 ①將小鼠脊椎脫臼處死，1小時(shí)后，4LD_(50)百草枯灌胃，將染毒的小鼠置于常溫環(huán)境下（20℃），分別于6、12、24、48、72、96h各解剖4只小鼠，取心、腎、腦、肺、右下肢肌肉，血液。將小鼠的肝臟分為四個(gè)部分，分別是：（Ⅰ）肝左葉；（Ⅱ）肝中間部分；（Ⅲ）肝右葉；（Ⅳ）肝基底部位。稱重，測(cè)其百草枯的含量；②將小鼠脊椎脫臼處死，1小時(shí)后，4LD_(50)百草枯灌胃，將染毒的小鼠分別置于4℃和-20℃，72h后解剖，取心、肝、腎、腦、肺、右下肢肌肉，血液，稱重，測(cè)其百草枯的含量；③將小鼠脊椎脫臼處死，1小時(shí)后，以2LD_(50)和8LD_(50)百草枯灌胃，將染毒的小鼠置于20℃，72h后解剖動(dòng)物，取心、肝、腎、腦、肺、右下肢肌肉、血液，稱量，測(cè)其百草枯的含量。 結(jié)果：（1）百草枯在小鼠體內(nèi)的死后分布：中毒小鼠死亡后體內(nèi)各個(gè)組織都檢測(cè)出百草枯，其中胃腸腎肝脾肺血液右下肢肌肉腦心；（2）埋葬尸體中百草枯隨時(shí)間變化：8LD_(50)灌胃致死小鼠埋葬尸體中PQ的含量呈現(xiàn)先上升，后下降的趨勢(shì)。埋葬42天后尸體心、肝、脾、肺、腎、胃、腸、腦、右下肢肌肉中百草枯含量升至最高，之后緩慢下降；（3）不同埋葬方式研究結(jié)果表明埋葬63天塑料袋包裝小鼠尸體心、肺、肝、腎、腦、肌肉中百草枯含量平均值均高于編織袋及木箱包裝，說(shuō)明編織袋保存尸體中百草枯分解較快，木箱次之，塑料袋最慢。（4）不同季節(jié)埋葬結(jié)果顯示：冬天埋葬的小鼠尸體心、肺、肝、腎、腦、肌肉中百草枯含量平均值均高于春天及夏天埋葬的小鼠；（5）死后6小時(shí)在小鼠體內(nèi)各臟器檢出百草枯，說(shuō)明百草枯在死后尸體內(nèi)是可以發(fā)生彌散的。肝左葉是百草枯集中的地方，其百草枯濃度/百草枯血液濃度的比值最高，達(dá)到7.87±2.32。另外肝臟中四個(gè)不同區(qū)域的百草枯平均濃度分別是13.57、11.94、3.89和3.36μg/g（肝左葉、肝基底部位、肝中間部位、肝右葉）。將每一只小鼠測(cè)定的不同組織中的百草枯濃度標(biāo)出，并作出各個(gè)臟器的線性關(guān)系，其中：肝（R~2=0.4565）、腎（R~2=0.3882）、肺（R~2=0.5414）、腦（R~2=0.6846）、心（R~2=0.6600）、右下肢肌肉（R~2=0.4937）；（6）不同儲(chǔ)存溫度結(jié)果顯示：72h后，20℃儲(chǔ)存的小鼠尸體中，心、肺、肝、腎、腦、右下肢肌肉中百草枯含量平均值均高于4℃及-20℃；（7）不同灌胃劑量結(jié)果顯示：8LD_(50)灌胃劑量的小鼠尸體中心、肺、肝、腎、腦、右下肢肌肉中百草枯含量平均值均高于2LD_(50)和4LD_(50)。 小結(jié)：（1）本實(shí)驗(yàn)分別采用8LD_(50)和4LD_(50)劑量百草枯灌胃染毒，建立了百草枯的死后分布和死后彌散模型，可應(yīng)用于百草枯中毒（死）的法醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)及法醫(yī)毒物動(dòng)力學(xué)研究。（2）8LD_(50)灌胃致死小鼠埋葬尸體中百草枯的含量呈現(xiàn)先上升，后下降的趨勢(shì)。埋葬42天后尸體心、肝、脾、肺、腎、胃、腸、腦、右下肢肌肉中百草枯含量升至最高，之后緩慢下降。埋葬126天后，小鼠心、肝、脾、胃、腎、肺、腸、右下肢肌肉仍能檢測(cè)到百草枯；不同埋葬方式對(duì)中毒小鼠體內(nèi)百草枯的含量有一定影響，編織袋分解較快，木箱次之，塑料袋最慢；埋葬季節(jié)對(duì)中毒小鼠體內(nèi)百草枯的含量也有影響，冬天溫度低，百草枯分解較慢；夏天溫度高，百草枯分解較快。（3）小鼠死后1小時(shí)4LD_(50)百草枯灌胃后，6h后可在其各個(gè)臟器中檢測(cè)到百草枯，說(shuō)明百草枯在小鼠體內(nèi)可發(fā)生死后彌散。從肝臟四個(gè)部分可以看出，離胃越近的部分，彌散的濃度越大。這與百草枯本身的理化性質(zhì)、染毒劑量、尸體保存溫度及時(shí)間、彌散距離和尸體的姿勢(shì)有關(guān)。（4）在百草枯中毒死亡埋葬尸體法醫(yī)學(xué)鑒定時(shí)，應(yīng)根據(jù)埋葬時(shí)間、埋葬方式、埋葬季節(jié)、服毒劑量等因素對(duì)尸體中百草枯分解的影響，結(jié)合中毒方式和生前搶救情況，及早進(jìn)行尸體挖掘和檢驗(yàn)，全面取材，大致推斷埋葬當(dāng)時(shí)尸體中百草枯的含量范圍。除了要提取胃內(nèi)容物、肺、心血等常見的檢材外，還應(yīng)當(dāng)采取腎，肝，脾，腦等組織進(jìn)行定性、定量分析，并充分考慮毒物的劑量、死亡時(shí)間、尸體所處的環(huán)境、體內(nèi)微生物等影響因素，結(jié)合臨床表現(xiàn)、病理報(bào)告等綜合分析，為百草枯誤服案件、中毒死亡案件和死后灌毒案件的甄別提供科學(xué)客觀的依據(jù)。 第三部分單胺類神經(jīng)遞質(zhì)在百草枯中毒小鼠血、腦組織中的變化研究 目的：（1）建立單胺類神經(jīng)遞質(zhì)在小鼠血液和腦中的檢測(cè)方法；（2）研究百草枯中毒小鼠血液和腦中單胺類神經(jīng)遞質(zhì)含量的變化情況。 方法：（1）條件優(yōu)化：本研究采用高效液相色譜—庫(kù)侖陣列電化學(xué)檢測(cè)器（HPLC-ECD）對(duì)小鼠血液及腦組織中的單胺類神經(jīng)遞質(zhì)及其代謝產(chǎn)物的檢測(cè)方法進(jìn)行了系統(tǒng)研究。通過對(duì)樣品的前處理方法的改進(jìn)，對(duì)檢測(cè)電極電勢(shì)的選擇和流動(dòng)相條件的優(yōu)化，確定了小鼠血液及腦組織中神經(jīng)遞質(zhì)及其代謝產(chǎn)物的含量的檢測(cè)條件。 （2）動(dòng)物實(shí)驗(yàn)：對(duì)照組：健康雄性昆明小鼠，40~45g；中毒組：將健康昆明小鼠以10mg/kg灌胃后，分別于1、3、7、14、21天斷頭處死，解剖（解剖前注入肝素，以防血液凝固），取心血、腦。小鼠血液前處理用固相萃取；小鼠腦組織樣品直接用5%的磺基水楊酸處理，取50μl直接進(jìn)入HPLC進(jìn)行檢測(cè)。 結(jié)果：（1）條件優(yōu)化： ①檢測(cè)小鼠血液中兒茶酚胺的色譜條件為：流動(dòng)相緩沖液為20mmol/L檸檬酸三鈉，用HCl調(diào)pH為3.25，經(jīng)0.22μm的濾膜過濾后加11%（v/v）的甲醇，應(yīng)用前經(jīng)超聲脫氣，流速為0.5ml/min，柱溫保持25℃，電化學(xué)檢測(cè)器電壓設(shè)置為0.85V。在此條件下，NE、E、DA在0.5~40ng/ml呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，檢出限依次為0.4、0.4、0.2ng/ml，回收率為89.0%~100.0%，日內(nèi)及日間RSD均小于6%。 ②檢測(cè)小鼠腦中神經(jīng)遞質(zhì)的色譜條件為：流動(dòng)相緩沖液為20mmol/L檸檬酸三鈉，HCl調(diào)pH4.25，經(jīng)0.22μm的濾膜過濾后加10%（v/v）的甲醇，應(yīng)用前經(jīng)超聲脫氣，流速為1.0ml/min，柱溫保持25℃，電化學(xué)檢測(cè)器電壓設(shè)置為0.75V。在此條件下，DA、MHPG、5-HT、DOPAC、5-HIAA、HVA在10~1000ng/ml呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，其檢出限為依次為0.2、0.4、0.1、0.4、0.1、0.3ng/ml，六種神經(jīng)遞質(zhì)的回收率在86.6%~94.5%，日內(nèi)及日間RSD均小于5%。 （2）動(dòng)物實(shí)驗(yàn)： ①正常及中毒組小鼠血液中兒茶酚胺類物質(zhì)的測(cè)定：中毒后小鼠的兒茶酚胺含量比正常組的平均值低，到21天后，中毒小鼠血液中的NE、E、DA分別是正常組的53%、73%和40%，達(dá)到了極顯著差異（P0.01）。 ②正常及中毒組小鼠腦組織中六種單胺類神經(jīng)遞質(zhì)的測(cè)定：中毒后小腦中的神經(jīng)遞質(zhì)含量比正常組的平均值低，到21天后，中毒小鼠腦中的DA、DOPAC、HVA、MHPG、5-HT、5-HIAA分別是正常組的77%、82%、58%、85%、81%和84%，DA達(dá)到了顯著差異（P0.05），其余五組達(dá)到了極顯著差異（P0.01）。 小結(jié)：（1）本文對(duì)所建立的方法均進(jìn)行了周密的驗(yàn)證，結(jié)果顯示此方法準(zhǔn)確、靈敏，操作簡(jiǎn)單，方便快捷，適宜生物樣品的檢測(cè)；（2）NE、E、DA、DOPAC、5-HT、5-HIAA、MHPG及HVA都是中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)重要的神經(jīng)遞質(zhì)，在神經(jīng)信號(hào)的傳遞中發(fā)揮重要作用，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明百草枯可導(dǎo)致小鼠血液中兒茶酚胺及腦組織中單胺類神經(jīng)遞質(zhì)含量減少，影響神經(jīng)興奮的傳遞，對(duì)小鼠神經(jīng)系統(tǒng)具有一定的毒性作用。 結(jié)論：本研究建立了兩種檢測(cè)除草劑百草枯的新方法（CE-UV，ECD），并分別與傳統(tǒng)經(jīng)典高效液相方法做了對(duì)比，發(fā)現(xiàn)其檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確，檢測(cè)范圍較寬，能滿足實(shí)際樣品的測(cè)定需要，可以在法醫(yī)毒物分析中進(jìn)行應(yīng)用。 創(chuàng)建了百草枯急性中毒的小鼠模型，在此基礎(chǔ)上對(duì)百草枯在小鼠體內(nèi)的死后分布、死后再分布及死后彌散進(jìn)行了一系列的研究，發(fā)現(xiàn)8LD_(50)灌胃致死小鼠埋葬尸體中百草枯的含量先上升，后下降，在42天達(dá)到極值；埋葬126天后，小鼠各個(gè)臟器仍能檢測(cè)到百草枯。小鼠死后1小時(shí)4LD_(50)百草枯灌胃后，6h后可在其各個(gè)臟器檢測(cè)到百草枯，說(shuō)明其在小鼠體內(nèi)可以發(fā)生死后彌散，且離胃越近的部位，彌散的濃度越大。 建立了單胺類神經(jīng)遞質(zhì)在小鼠血液和腦中的檢測(cè)方法，并且研究了百草枯中毒前后小鼠血液和腦中單胺類神經(jīng)遞質(zhì)（NE、E、DA、DOPAC、5-HT、5-HIAA、MHPG及HVA）含量的變化情況，結(jié)果顯示百草枯可導(dǎo)致小鼠血液中兒茶酚胺及腦組織中單胺類神經(jīng)遞質(zhì)隨著時(shí)間的延長(zhǎng)而減少（21d），影響神經(jīng)興奮的傳遞，對(duì)小鼠神經(jīng)系統(tǒng)具有一定的毒性。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：河北醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號(hào)】：D919.4

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：1362366