本文關(guān)鍵詞：束縛應(yīng)激加重?cái)D壓傷大鼠心臟損害及其內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激機(jī)制

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【摘要】：目的：在法醫(yī)學(xué)實(shí)踐中，非致命機(jī)械性損傷后發(fā)生心衰，甚至死亡的案件與日劇增。此類案件多見于爭(zhēng)執(zhí)、打架、刑訊逼供、虐待等，也可見于交通事故和礦難等意外事故。此類損傷本身不足以導(dǎo)致當(dāng)事人死亡，而且死者生前往往沒有明顯的心血管疾病，因此常常由于死亡原因不能確定或有爭(zhēng)議，導(dǎo)致案件久拖不決，給社會(huì)造成不良影響。此外，在臨床實(shí)踐中也經(jīng)常發(fā)生非致命傷患者在治療期間病情逐漸加重甚至突發(fā)心衰的情況，致使醫(yī)務(wù)人員難以應(yīng)對(duì)。因此研究非致命性機(jī)械性損傷導(dǎo)致心衰甚至死亡的機(jī)制是法醫(yī)學(xué)亟待解決的問(wèn)題。 損傷對(duì)機(jī)體的影響除了局部組織損傷，或進(jìn)一步引發(fā)全身炎癥反應(yīng)和遠(yuǎn)隔器官損傷以外還可以引起機(jī)體的應(yīng)激反應(yīng)，其中損傷本身屬于軀體應(yīng)激原；此外，當(dāng)事人在遭受損傷后由于各種原因往往會(huì)產(chǎn)生焦慮、緊張或抑郁等不良情緒，這些負(fù)性情緒屬于心理應(yīng)激原[1]。應(yīng)激時(shí)下丘腦垂體腎上腺皮質(zhì)軸（hypothalamic-pituitary-adrenal, HPA軸）和藍(lán)斑交感腎上腺髓質(zhì)系統(tǒng)（locus cereus norepinephrine axis, LC/NE軸）激活，血液及尿液中兒茶酚胺和糖皮質(zhì)激素水平升高[2]。適度應(yīng)激對(duì)于機(jī)體抗損傷具有重要的防御意義，但過(guò)度強(qiáng)烈的應(yīng)激可引起組織器官損傷。而應(yīng)激是否參與非致命性機(jī)械性損傷導(dǎo)致心衰的過(guò)程，尚不清楚。 應(yīng)激原作用于機(jī)體后，除了引起整體水平的應(yīng)激反應(yīng)外，還可以導(dǎo)致細(xì)胞水平的應(yīng)激，使細(xì)胞出現(xiàn)一系列適應(yīng)性代償反應(yīng)。細(xì)胞水平的應(yīng)激主要包括熱休克反應(yīng)（heat shock response, HSR）和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激（endoplasmicreticulum stress, ERS)兩種。而近些年，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激越來(lái)越受到研究人員的廣泛重視，國(guó)內(nèi)外也有相關(guān)文獻(xiàn)指出，心臟的多種疾病的發(fā)生都與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激有關(guān)。真核細(xì)胞的膜蛋白及分泌性蛋白是在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中合成后，經(jīng)過(guò)翻譯后修飾，折疊和組裝，由高爾基體進(jìn)一步加工后轉(zhuǎn)運(yùn)到膜上或分泌到細(xì)胞外。當(dāng)受到各種應(yīng)激原刺激時(shí)，新生肽鏈的修飾折疊與組裝受到干擾，將引起未折疊蛋白在ER中堆積，使細(xì)胞發(fā)生ERS，并激活未折疊蛋白反應(yīng)信號(hào)傳導(dǎo)通路（unfolded protein response, UPR），幫助錯(cuò)誤折疊蛋白恢復(fù)正常折疊，以提高細(xì)胞在有害因素下的生存能力。其中葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白（glucose-regulated protein, GRP78）表達(dá)增加是UPR通路激活的標(biāo)志蛋白[4]。但是當(dāng)細(xì)胞自身處理能力不及應(yīng)激原強(qiáng)度時(shí)，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)一方面會(huì)啟動(dòng)其特有的凋亡信號(hào)，以C/EBP同源蛋白(C/EBP homologous protein, CHOP)表達(dá)增多為標(biāo)志；另一方面還可激活炎癥信號(hào)通路。越來(lái)越多的證據(jù)表明UPR的信號(hào)通路與炎性反應(yīng)通路之間是通過(guò)不同的機(jī)制是相互聯(lián)系的[19]。因此，強(qiáng)烈的應(yīng)激原可通過(guò)誘導(dǎo)ERS引起細(xì)胞凋亡和炎癥反應(yīng)，造成組織損傷。有文獻(xiàn)報(bào)道，ERS參與多種心血管疾病的發(fā)生[4-6]。而ERS是否參與非致命性機(jī)械性損傷導(dǎo)致心肌損傷的過(guò)程尚不清楚。 為了模擬損傷和應(yīng)激共同參與的實(shí)際案件，本實(shí)驗(yàn)將采用擠壓傷與束縛應(yīng)激的復(fù)合模型，觀察束縛應(yīng)激對(duì)擠壓傷大鼠心臟損傷的影響，并進(jìn)一步探討內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激在其中的作用。 方法： 1.分組: Sprague Dawley(SD)大鼠36只，雄性，體重200g-220g，適應(yīng)性喂養(yǎng)7天后，，隨機(jī)分組，每組6只。正常組，對(duì)照組，束縛應(yīng)激組，擠壓組，應(yīng)激后擠壓組，應(yīng)激加擠壓加內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激抑制劑組。①正常組：24小時(shí)正常喂養(yǎng)，每天與其他組造模前后分別稱重；②禁食水組：每天在束縛應(yīng)激組8小時(shí)內(nèi)禁食水，其余時(shí)間自由飲食活動(dòng)，連續(xù)7天，并分別在造模前后稱取大鼠體重；③束縛應(yīng)激組：實(shí)驗(yàn)時(shí)每天在相同時(shí)間將大鼠置于固定器中限制其活動(dòng)8小時(shí)，其余時(shí)間大鼠自由飲食活動(dòng)，連續(xù)束縛應(yīng)激7天。實(shí)驗(yàn)開始及造模結(jié)束時(shí)分別稱重；④擠壓組：實(shí)驗(yàn)時(shí)乙醚麻醉后，把大鼠俯臥位固定于鼠臺(tái)上，于雙后肢上壓24kg重物，連續(xù)擠壓6h，然后去除重物、釋放大鼠，任其自由飲食、活動(dòng)；⑤復(fù)合模型組：在連續(xù)7天束縛應(yīng)激結(jié)束后，于次日乙醚麻醉，把大鼠俯臥位固定于鼠臺(tái)上，于雙后肢上壓24kg重物，連續(xù)擠壓6h，然后去除重物、釋放大鼠，任其自由飲食、活動(dòng)；⑥ERS抑制劑組，每天分別在束縛應(yīng)激之前半小時(shí)按10mg/ml腹腔給予內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激抑制劑4苯基丁酸（4-Phene butyric,4-PBA）后進(jìn)行連續(xù)束縛應(yīng)激7天后擠壓，方法同上。 2.正常組，對(duì)照組和束縛應(yīng)激組分別于造模結(jié)束即刻取大鼠心臟組織；擠壓組，復(fù)合模型組以及ERS抑制劑組分別于造模結(jié)束后5天取大鼠心臟組織固定，脫水透明，浸蠟包埋，做石蠟切片，石蠟切片進(jìn)行HE染色觀察心肌組織病理學(xué)改變及應(yīng)用免疫組織化學(xué)染色方法觀察大鼠心肌組中GRP78、CHOP蛋白的表達(dá)變化。 3.留取各個(gè)組大鼠心尖組織-80℃凍存，應(yīng)用Western印跡法檢測(cè)大鼠心肌組織GRP78、CHOP、Caspase3蛋白的表達(dá)變化及ELISA檢測(cè)心肌組織炎癥因子IL-1的表達(dá)量改變。 4.用SPSS13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(Mean±SD)表示。各組均數(shù)的比較行單因素方差分析（ANOVA），以最小顯著差異法做兩兩比較，以p＜0.05為有顯著差異。 結(jié)果： 1心臟HE染色 正常組，禁食水組可見心肌纖維排列整齊，結(jié)構(gòu)清晰，細(xì)胞大小一致，。而在束縛應(yīng)激組心肌間質(zhì)可見少量炎細(xì)胞浸潤(rùn)。擠壓組心肌間質(zhì)內(nèi)炎細(xì)胞增多，局部肌纖維細(xì)胞嗜伊紅染色加深。但與擠壓傷組相比，復(fù)合模型組肌纖組織病理學(xué)變化更加嚴(yán)重，出現(xiàn)肌纖維排列紊亂，部分心肌纖維呈波浪樣變。與復(fù)合模型組相比，給予ERS抑制劑后心肌病理學(xué)改變明顯減輕，表現(xiàn)為間質(zhì)炎細(xì)胞明顯減少，不規(guī)則的病理收縮帶減少，收縮帶周圍的正常組織無(wú)波浪樣變。 2心肌內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激標(biāo)志蛋白GRP78表達(dá)情況 免疫組化結(jié)果：在正常組與禁食水組心肌排列整齊，可見少量陽(yáng)性表達(dá)。束縛應(yīng)激組、擠壓組、復(fù)合模型組胞漿著色逐漸加深，陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)目有所增加，陽(yáng)性表達(dá)輕度增加。陽(yáng)性細(xì)胞發(fā)生凋亡的形態(tài)學(xué)改變，細(xì)胞皺縮。而ERS抑制劑組與復(fù)合模型組相比陽(yáng)性細(xì)胞明顯減少，陽(yáng)性表達(dá)減弱。Western印跡檢測(cè)結(jié)果：正常組及禁食水組只有少量GRP78表達(dá)，束縛應(yīng)激組、擠壓組表達(dá)逐漸增加，與擠壓組比較，復(fù)合模型組GRP78表達(dá)明顯增加，而給予ERS抑制劑可顯著抑制GRP78表達(dá)，該結(jié)果與免疫組化結(jié)果一致。 3心肌內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激凋亡相關(guān)蛋白CHOP以及凋亡執(zhí)行者caspase3的表達(dá)情況。 CHOP免疫組化結(jié)果：在正常組與禁食水組心肌纖維排列整齊，未見陽(yáng)性表達(dá)。束縛應(yīng)激組、擠壓組、復(fù)合模型組胞漿著色由淺及深，陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)逐漸增多，陽(yáng)性表達(dá)逐漸增強(qiáng)，陽(yáng)性細(xì)胞發(fā)生凋亡的形態(tài)學(xué)改變，細(xì)胞皺縮，細(xì)胞核碎裂、溶解。與復(fù)合模型組相比，給予ERS抑制劑后胞漿著色變淺，陽(yáng)性表達(dá)減弱。CHOP Western印跡檢測(cè)結(jié)果：正常組及禁食水組幾乎沒有表達(dá)，束縛應(yīng)激組、擠壓組表達(dá)逐漸增加與擠壓組相比，復(fù)合模型組表達(dá)明顯增加，給予ERS抑制劑可顯著抑制CHOP表達(dá)，該結(jié)果與免疫組化結(jié)果一致。caspase3的Western結(jié)果與CHOP結(jié)果一致。 4心肌白細(xì)胞介素IL-1表達(dá)水平 正常組和禁食水組IL-1表達(dá)量很少；束縛組、擠壓組表達(dá)量依次增多，與擠壓組相比，復(fù)合模型組IL-1表達(dá)量明顯升高；ERS抑制劑組IL-1表達(dá)量較復(fù)合模型組有所減少。 結(jié)論: 本研究首次成功地建立了束縛應(yīng)激和擠壓傷的復(fù)合模型，觀察了大鼠心臟的組織病理學(xué)、檢測(cè)了ERS標(biāo)志蛋白的表達(dá)以及炎癥因子水平變化得出以下結(jié)論： 束縛應(yīng)激可以加重?cái)D壓傷大鼠心肌組織的損害，其機(jī)制與ERS誘導(dǎo)凋亡和炎癥有關(guān)。
【學(xué)位授予單位】：河北醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號(hào)】：D919.1

【共引文獻(xiàn)】

中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前10條

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2 呂存賢;;血府逐瘀湯治療髖關(guān)節(jié)置換術(shù)后非感染性發(fā)熱[J];浙江中醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào);2006年01期

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4 馬宇杰;田煒;焦文蘭;陳朔華;;入院時(shí)APACHEⅡ評(píng)分值對(duì)預(yù)測(cè)創(chuàng)傷后遠(yuǎn)期高血壓的應(yīng)用價(jià)值[J];重慶醫(yī)學(xué);2011年06期

5 季勇;黃亮;郭國(guó)明;李閩云;;高頻程序通氣對(duì)心肺復(fù)蘇中心肌損傷標(biāo)志物的影響[J];重慶醫(yī)學(xué);2011年33期

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10 禮曉明;李學(xué)金;張s

本文編號(hào)：1262179