本文關(guān)鍵詞：LINE-1 DNA甲基化：鑒別同卵雙生個體的潛在遺傳標記

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【摘要】：目的：由于同卵雙生子（monozygotictwins，MZ）是由一個受精卵分裂成兩個胚胎進而發(fā)育成的兩個個體，他們具有完全相同或極其相似的基因組DNA序列，應(yīng)用現(xiàn)有的DNA遺傳標記無法有效區(qū)分MZ的兩個個體，導(dǎo)致一些與MZ有關(guān)的案件無法偵破。因此，，如何從遺傳學(xué)角度準確認定MZ的兩個個體，是法醫(yī)學(xué)DNA分析領(lǐng)域亟待解決的難題。5-甲基胞嘧啶（5-methylcystein，5mC）即在胞嘧啶的第5位碳原子上添加一個甲基，被稱作第6種堿基，是一種重要的表觀遺傳現(xiàn)象。近來研究發(fā)現(xiàn)MZ個體之間5mC存在差異。本課題組前期研究檢測了1對新生兒MZ的全基因組甲基化譜，發(fā)現(xiàn)有2205條存在DNA甲基化差異的序列，這些差異序列大部分分布在重復(fù)序列，尤以散在重復(fù)序列為著，如短散布元件Alu序列和長散布元件（longinterspersedelements,LINE-1）。LINE-1在人類基因組的拷貝數(shù)大于50萬，占人類基因組的17%，因此其甲基化程度可代表核基因組的甲基化程度。本研究擬對LINE-1序列的DNA甲基化水平進行大樣本雙生子調(diào)查，以評估其鑒別MZ的能力以及潛在的應(yīng)用價值。 方法：按照知情同意原則，收集了176對雙生子血液樣本及漱口水樣本。應(yīng)用QIAampDNABloodkit提取血液樣本的全基因組DNA，應(yīng)用漱口水提取試劑盒提取漱口水的全基因組DNA。用GoldeneyeDNA身份鑒定系統(tǒng)BASIC試劑盒檢測DNA樣本的19個常染色體短串聯(lián)重復(fù)序列（shorttandemrepeat,STR）基因座分型，以確定每對雙生子樣本的同異卵情況。應(yīng)用EZDNAMethylation-GoldKit對基因組DNA進行亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)化，以轉(zhuǎn)化的DNA為模板，擴增LINE-1靶序列。對擴增產(chǎn)物進行單鏈純化后，用PyroMarkGoldQ96Reagents和PyroMarkID焦磷酸測序儀進行焦磷酸測序反應(yīng)，每個樣本重復(fù)三次，獲得LINE-1序列3個CpG位點甲基化程度的定量數(shù)據(jù)。應(yīng)用主成份分析、Spearman相關(guān)檢驗、配對t檢驗、方差分析、秩和檢驗等方法進行統(tǒng)計學(xué)分析。 結(jié)果： 1樣本概況 經(jīng)STR分型鑒定，176對血液樣本包含119對MZ和57對DZ，64對漱口水樣本包含50對MZ及14對DZ。 2LINE-1靶序列DNA甲基化水平及位點間的相關(guān)性分析 在所調(diào)查的352個血液樣本中，3個CpG位點甲基化平均值分別為81.26%、73.91%、74.74%；在128個漱口水樣本中，分別為73.18%、69.86%、67.85%，明顯低于血液樣本。配對t檢驗結(jié)果也證實，3個CpG位點甲基化在同一個體血液與漱口水樣本中存在顯著差異，漱口水樣本中的甲基化程度顯著低于血液中的甲基化程度。此外，相關(guān)系數(shù)矩陣分析顯示3個CpG位點甲基化具有一定的相關(guān)性。 3MZ、DZ個體間LINE-1DNA甲基化水平差異分析 每對MZ或DZ兩個個體之間甲基化水平進行配對t檢驗，結(jié)果顯示其中15對MZ及10對DZ兩個個體之間甲基化水平具有顯著差異，分別占MZ及DZ總樣本量的12.61%及17.54%，表明本研究選取的3個CpG位點甲基化能夠鑒別12.61%的MZ和17.54%的DZ，即其鑒別DZ的能力略高于MZ。通過對MZ及DZ兩個個體間甲基化差異與年齡進行相關(guān)性分析，發(fā)現(xiàn)無論MZ還是DZ，其差異均與年齡無明顯相關(guān)性。比較MZ之間與DZ之間甲基化差值的差異程度，發(fā)現(xiàn)二者無顯著差異。 4年齡和性別對LINE-1DNA甲基化的影響 提供血液樣本的志愿者包括176對雙生子，年齡0～74歲。我們按照10歲的年齡段將樣本分為5個年齡組：0-10歲、11-20歲、21-30歲、31-40歲、41-50歲及50歲。通過主成分分析，分別應(yīng)用PC1及CpGmean（焦磷酸測序儀測出的3個CpG位點甲基化水平的平均值）與年齡及性別進行相關(guān)性分析，結(jié)果顯示：在血液樣本中，年齡與PC1及CpGmean值均沒有明顯的相關(guān)性，秩和檢驗結(jié)果也表明各年齡組間的PC1值及CpGmean值均無統(tǒng)計學(xué)差異。但在漱口水樣本中，PC1及CpGmean值與年齡均呈正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)分別為0.382和0.378；各年齡組間的PC1值及CpGmean值也具有顯著性差異。 樣本的性別組成：血液樣本包括168名男性及184名女性，漱口水樣本包括44名男性及84名女性。在漱口水樣本，男性與女性之間的PC1值及CpGmean值無顯著性差異，而在血液樣本，女性樣本的CpGmean及PC1的平均值略低于男性樣本，具有統(tǒng)計學(xué)意義。 5不同民族和居住地對LINE-1DNA甲基化的影響 樣本志愿者來自三個民族：漢族、哈尼族及彝族，漢族志愿者主要來自河北和山西，少數(shù)來自云南，哈尼族和彝族志愿者均來自云南。相關(guān)分析及秩和檢驗均表明來自不同民族、不同居住地的樣本的LINE-1DNA甲基化程度均無顯著差異，表明民族和居住地對其無影響。 6職業(yè)和教育程度對LINE-1DNA甲基化的影響 為評價不同職業(yè)對LINE-1DNA甲基化是否有影響，將樣本分為腦力勞動組（88個血液樣本、37個漱口水樣本）、體力勞動組（31個血液樣本、10個漱口水樣本）、未成年人組（68個血液樣本、30個漱口水樣本）及其他（21個血液樣本、11個漱口水樣本）。相關(guān)分析及秩和檢驗結(jié)果表明，無論在血液樣本還是漱口水樣本，不同職業(yè)的PC1及CpGmean的平均值均具有顯著差異。 為進一步探討教育程度是否也是LINE-1DNA甲基化的影響因素，將樣本分為四種教育程度：碩士及以上程度（5個血液樣本、0個漱口水樣本）、大學(xué)程度（16個血液樣本、7個漱口水樣本）、中學(xué)程度（16個血液樣本、10個漱口水樣本）、小學(xué)程度（136個血液樣本、73個漱口水樣本）。血液樣本PC1值及CpGmean與教育程度均具有相關(guān)性，相關(guān)系數(shù)分別為0.162及0.161。秩和檢驗也證實，PC1值及CpGmean在不同教育水平之間的差別具有統(tǒng)計學(xué)意義。 7吸煙對LINE-1DNA甲基化的影響 無論血液樣本還是漱口水樣本，吸煙組與不吸煙組的LINE-1DNA甲基化PC1值及CpGmean的平均值均無顯著差異。 結(jié)論：本研究應(yīng)用焦磷酸測序技術(shù)對LINE-1序列中的3個CpG位點DNA甲基化進行定量分析，可鑒別MZ個體，鑒別能力為12.61%。雖然鑒別能力不高，但為解決法醫(yī)學(xué)MZ識別難題提供了初步可行的解決方案，后續(xù)研究將增加檢測的位點，提高檢測系統(tǒng)的累積鑒別能力，具有一定的應(yīng)用前景。由于LINE-1DNA甲基化具有組織差異性及年齡相關(guān)性，在實際應(yīng)用中必須考慮樣本組織類型及年齡的影響。
【學(xué)位授予單位】：河北醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號】：D919.1

【參考文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前10條

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6 徐酩;呂京o

本文編號：1261408