本文關(guān)鍵詞：基于不同長(zhǎng)度的COI和COII基因片段分子鑒定嗜尸性雙翅目昆蟲

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【摘要】：1季節(jié)性演替實(shí)驗(yàn)鑒定法醫(yī)學(xué)重要節(jié)肢動(dòng)物 背景 法醫(yī)昆蟲學(xué)(forensic entomology)研究?jī)?nèi)容主要是對(duì)在尸體內(nèi)、尸體表面或尸體附近采集到的昆蟲標(biāo)本,進(jìn)行檢驗(yàn)、鑒定、分類后,明確昆蟲種類或確定某一昆蟲生長(zhǎng)發(fā)育狀態(tài),結(jié)合昆蟲在尸體上的生態(tài)群落演替,幫助法醫(yī)完成死亡時(shí)間(postmortem interval, PMI)的推斷。昆蟲在尸體上是按一定的次序出現(xiàn)并繁殖。目前,在埃及有關(guān)不同腐敗階段的動(dòng)物區(qū)系演替實(shí)驗(yàn)和他們?cè)诜缮蠎?yīng)用報(bào)道還很少。而且,也沒(méi)有埃及東北部有關(guān)法醫(yī)重要意義昆蟲的數(shù)據(jù)報(bào)道。 目的 1.第一次在埃及東北部(32015'E,30°36'N)調(diào)查法醫(yī)重要性意義的昆蟲。 2.調(diào)查冬夏季節(jié)動(dòng)物尸體上的主要昆蟲類群,并分析尸體分解速度的季節(jié)性差異。 3.觀察最早到達(dá)尸體的雙翅目種類及嗜尸性昆蟲的演替規(guī)律。 方法： 1.連續(xù)2年(2011/2012)的冬夏季節(jié)用動(dòng)物尸體進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。 2.在每次觀察中,檢查尸體的腐敗階段,采集不同發(fā)育階段的有代表性的樣本(死的和活著的樣本),并記錄溫度和相對(duì)濕度等環(huán)境變量。 3.請(qǐng)分類專家依據(jù)本地物種的形態(tài)學(xué)特征對(duì)物種行形態(tài)學(xué)鑒定。 結(jié)果 1.夏季在動(dòng)物尸體上取得了3目7科10種的物種,而冬季在動(dòng)物尸體上獲得了4目8科12種的物種。雖然在冬季可以收集到更豐富的樣本物種,但在夏季每個(gè)物種的樣本數(shù)量更多。 2.一般情況下,蠅科和廁蠅科在夏季研究中占主導(dǎo)地位而麻蠅科在冬季占主導(dǎo)地位。 3.冬季動(dòng)物尸體的分解的速度明顯慢于在夏季的速度。 4.相比夏季,在冬季雙翅目到達(dá)尸體明顯延遲。夏季最先到達(dá)尸體的類群是家蠅,而在冬季最先到達(dá)的白頭裸金蠅。 5.通過(guò)分析所收集到的樣本,構(gòu)建了夏季和冬季的物種的共生矩陣表。 結(jié)論 本研究結(jié)果提示開展地域性昆蟲演替規(guī)律調(diào)查研究是十分重要的,在不同的區(qū)域范圍內(nèi)確定最有可能出現(xiàn)的昆蟲種類對(duì)于法醫(yī)學(xué)案例也至關(guān)重要。演替實(shí)驗(yàn)也是評(píng)估分子標(biāo)記鑒定能力的一個(gè)基本步驟。 2細(xì)胞色素氧化酶基因Ⅰ (COⅠ):利用短片段和長(zhǎng)片斷鑒定嗜尸性雙翅目昆蟲 背景 在法醫(yī)學(xué)領(lǐng)域,正確的鑒定是一個(gè)關(guān)鍵性的問(wèn)題,因?yàn)橛腥毕莸姆ㄡt(yī)學(xué)證據(jù)可能導(dǎo)致審判不公。在以被準(zhǔn)確評(píng)估后的遺傳標(biāo)記為指導(dǎo)的鑒定工具包中,以分子為基礎(chǔ)的方法被認(rèn)為是一個(gè)重要工具。本文第一次使用線粒體細(xì)胞色素氧化酶基因Ⅰ (COⅠ)的272-bp和1173-bp兩個(gè)片斷對(duì)來(lái)自埃及的嗜尸性昆蟲進(jìn)行評(píng)估。并且,由于現(xiàn)有中國(guó)的相關(guān)數(shù)據(jù)全部來(lái)自對(duì)短片段的研究,本文也第一次使用COI的長(zhǎng)片斷對(duì)中國(guó)的嗜尸性昆蟲進(jìn)行評(píng)估。因此,這些研究對(duì)于確定以上片斷的適用性是非常有意義的。從兩個(gè)地區(qū)收集到的樣本對(duì)于使用這些分子標(biāo)記鑒定物種和種群具有重要意義。 目的 -確定COI長(zhǎng)、短兩個(gè)片斷對(duì)于鑒定嗜尸性雙翅目昆蟲的鑒別效力,并且通過(guò)以下三個(gè)方面評(píng)估和比較這兩個(gè)片斷： 1、種內(nèi)及種間差異 2、所研究物種的單系分離 3、通過(guò)鄰接法建立于與分類學(xué)一致的系統(tǒng)發(fā)育樹 -確定這些片斷在種群水平上鑒定同種的鑒別效力。 方法 1、形態(tài)學(xué)鑒定來(lái)自18個(gè)物種的50個(gè)樣本。 2、DNA提取。 3、使用兩個(gè)片斷的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增,之后產(chǎn)物直接用于測(cè)序。 4、使用Kimura雙參數(shù)距離模型(K2P)對(duì)核苷酸序列的分歧進(jìn)行計(jì)算,通過(guò)鄰接法(NJ)建立系統(tǒng)發(fā)育樹。 結(jié)果 1、在種內(nèi)和種間差異中兩個(gè)片斷顯示了類似的結(jié)果。 2、長(zhǎng)片斷能夠以高的自舉值完整地區(qū)分單系物種,明顯優(yōu)于短片段。 3、使用長(zhǎng)片斷對(duì)這些物種建立的NJ系統(tǒng)發(fā)育樹與分類學(xué)結(jié)果較為一致,遠(yuǎn)遠(yuǎn)優(yōu)于短片段。 結(jié)論 1、COI長(zhǎng)片段的鑒定結(jié)果更為可靠和安全,因?yàn)樗軌騼?yōu)化分歧,特別是對(duì)那些具有低水平分歧的物種。 2、長(zhǎng)片斷另外一個(gè)優(yōu)點(diǎn)是除了能夠得到與形態(tài)學(xué)分類相一致的結(jié)果之外,還特別適用于鑒定已建立本地?cái)?shù)據(jù)庫(kù)中的新物種。 3、在種群水平上COI基因不能區(qū)分同種昆蟲。 3細(xì)胞色素氧化酶基因Ⅱ：利用短片段鑒定嗜尸性雙翅目昆蟲 背景 由于相對(duì)較高的變異度,細(xì)胞色素氧化酶基因Ⅱ可以成功用于進(jìn)化學(xué)研究、群體遺傳學(xué)和分類學(xué)。然而,僅有少數(shù)文獻(xiàn)報(bào)道使用該基因進(jìn)行嗜尸性蠅類鑒定。在將任何遺傳學(xué)標(biāo)記用于實(shí)際案例之前,需要對(duì)這些標(biāo)記進(jìn)行評(píng)估。為了作為可用的法醫(yī)學(xué)工具,這些標(biāo)記必須含有有效的變異區(qū)能在種及種群水平上產(chǎn)生唯一的標(biāo)識(shí)。由于短片段具有簡(jiǎn)單、低成本和很好的應(yīng)用前景,最近有文獻(xiàn)報(bào)道使用一個(gè)189-bp COⅡ片段鑒定來(lái)自中國(guó)的3種麻蠅。目前,在埃及沒(méi)有使用該片斷發(fā)表的數(shù)據(jù)。因此,本研究利用該片斷鑒定來(lái)自兩個(gè)不同地區(qū)的三科昆蟲(家蠅科、麻蠅科和蠅科)14種蠅類,進(jìn)而評(píng)估該片斷的實(shí)用性。 目的 通過(guò)以下方法評(píng)估長(zhǎng)度小于200-bp小片段的使用性： 1、測(cè)量種內(nèi)及種間差異。 2、在科水平上證實(shí)所研究物種的單系分離及正確歸類。 方法 1、形態(tài)學(xué)鑒定來(lái)自14個(gè)物種的53個(gè)樣本。 2、DNA提取。 3、使用該片斷的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增,之后產(chǎn)物直接用于測(cè)序。 4、使用Kimura雙參數(shù)距離模型(K2P)對(duì)核苷酸序列的分歧進(jìn)行計(jì) 算,通過(guò)鄰接法(NJ)建立系統(tǒng)發(fā)育樹。 結(jié)果 1、同種蠅類無(wú)種內(nèi)差異,種間差異為2%～25%。 2、除了H. melanura和秋家蠅M. autumnalis,所有樣品都正確的歸類。 結(jié)論 盡管分子生物學(xué)對(duì)于鑒定嗜尸性昆蟲是一種有效的方法,然而我們建議小于小于200-bp小片段用于鑒定僅僅是對(duì)傳統(tǒng)方法的補(bǔ)充。 4章基于COI和COⅡ基因利用PCR-RFLP技術(shù)鑒定嗜尸性麻蠅 背景 利用麻蠅進(jìn)行死亡時(shí)間推斷是十分有限的,因?yàn)槁橄壍男螒B(tài)學(xué)鑒定十分困難,無(wú)論是在幼蟲、蛹還是成蟲階段,它們都具有相似的特征。幾乎所有可用的PCR-RFLP數(shù)據(jù)都來(lái)自麗蠅科昆蟲。并且,對(duì)使用PCR-RFLP技術(shù)進(jìn)行物種鑒定仍存在爭(zhēng)議。目前,尚無(wú)來(lái)自中國(guó)或埃及有關(guān)被檢驗(yàn)的物種和分子標(biāo)記的數(shù)據(jù)。 目的 1、評(píng)估部分COI-COII基因的使用性；基于直接測(cè)序鑒定四種常見(jiàn)的嗜尸性麻蠅。 2、評(píng)估該P(yáng)CR-RFLP技術(shù)的實(shí)用性；基于COI-COII片斷,PCR-RFLP作為一種簡(jiǎn)單、快速和低成本的技術(shù)鑒定四種常見(jiàn)的嗜尸性麻蠅。 方法 1、形態(tài)學(xué)鑒定4個(gè)麻蠅物種。 2、DNA提取。 3、使用該片斷的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增,之后產(chǎn)物直接用于測(cè)序。 4、使用限制性內(nèi)切酶Hinfl和MfeI對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行酶切,使用電泳確定條帶圖譜。 5、使用Kimura雙參數(shù)距離模型(K2P)對(duì)核苷酸序列的分歧進(jìn)行計(jì)算,通過(guò)鄰接法(NJ)建立系統(tǒng)發(fā)育樹。 結(jié)果 1、所有被檢測(cè)樣品都正確的歸類。 2、聯(lián)合使用限制性內(nèi)切酶Hinfl和MfeI產(chǎn)生了不同的限制性片斷長(zhǎng)度多態(tài)性(RFLP)圖譜,并且對(duì)3種同地區(qū)的麻蠅同樣有效。 結(jié)論 本研究證實(shí)了基于部分COI-COII基因的PCR-RFLP技術(shù)可以正確的鑒定嗜尸性麻蠅。
【學(xué)位授予單位】：中南大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號(hào)】：D919.4

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