發(fā)布時間：2020-07-16 21:26

【摘要】：嗜酸性喜溫硫桿菌(Acidithiobacillus caldus,.caldus)是一種專性自養(yǎng)的硫氧化細菌,能夠通過還原性或部分還原性的硫化物的氧化反應(yīng)中獲得其生長所必須的能量和還原力,以卡爾文循環(huán)固定空氣中的CO2作為碳源,通常分布于酸性礦水、硫化礦床中,是生物浸礦中的優(yōu)勢菌,在生物冶金、含硫廢水的處理和煤的脫硫等方面起著重要的作用。嗜酸硫桿菌由于其特殊的生存方式和在自然界硫循環(huán)中的重要地位,一直以來受到人們的廣泛關(guān)注。但是,由于該菌化能自養(yǎng)的特性,生長緩慢且細胞得率較低,給研究帶來了一定的困難。因此,研究A.caldus的生長代謝及其對環(huán)境的適應(yīng)性是當前的首要課題。細菌在感知高滲透壓環(huán)境并快速應(yīng)答過程中,滲透壓調(diào)控子(osmolarity response regulator,ompR)起著關(guān)鍵作用,相關(guān)研究在腸桿菌科中研究最多也最深入。越來越多的研究顯示,除了滲透調(diào)節(jié)外,OmpR還有其他的調(diào)控功能,但在專性化能自養(yǎng)的嗜酸性喜溫硫桿菌中OmpR怎樣應(yīng)對浸礦環(huán)境的高滲透壓脅迫,它又直接調(diào)控哪些基因的表達并發(fā)揮其調(diào)控功能,至今未見報道。通過前期基因組測序了解到A.caadus MTH-04基因組中ompR基因存在兩個拷貝,分別為orf1207和orf2590。因此,探究ompR的調(diào)控機制不僅有助于探究A.caldus MTH-04如何適應(yīng)環(huán)境中的滲透壓的改變,而且對于完善硫代謝機制也有著及其重要的意義。本論文在國際上首次對A.caldus中ompR基因展開研究,主要包括以下幾個方面:第一,首次在A.caldus中實現(xiàn)ompR基因的無痕敲除。根據(jù)本實驗之前建立的A.caldus基因無痕敲除系統(tǒng),對A.caldus的orf1207和orf2590進行了無痕敲除,從而獲得了 株突變菌株,分別為 A.caldus(△orf1207)、A.caldus(△orf2590)及 A.caldus(△orf1207△orf2590);第二,首次在A.caldus中實現(xiàn)ompR突變體的表型分析。測定三株突變株與野生型菌株在不同滲透壓下的生長曲線,比較菌株對高滲透壓的敏感性,推測ompR2590在滲透壓調(diào)節(jié)中發(fā)揮著更大的作用;利用流式細胞儀檢測高滲透壓下細菌的生理狀態(tài),發(fā)現(xiàn)高滲透壓長時間刺激菌株后,細胞膜的通透性增加,菌株的細胞膜遭到破壞;第三,首次在A.caldus中探究ompR調(diào)控元及其調(diào)控機制。利用鏈特異性轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù),在mRNA的水平上比較了在高滲透壓刺激下與野生型菌株相比ompR突變株基因差異表達情況;利用實時熒光定量PCR(Real time RT-PCR)對轉(zhuǎn)錄組測序篩選出并預(yù)測可能受OmpR調(diào)控的基因做了進一步驗證;第四,首次對A.caldus的ompR基因進行了分析鑒定,成功的在E.coli BL21(DE3)中實現(xiàn)ompR(orfl207)及ompR(orf2590)的異源表達,并獲得純化的OmpR蛋白;使用等溫滴定量熱儀MicroCaliTC 200初步測得ompR2590能夠與tetH發(fā)生相互作用。
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：TF18
【圖文】：

ｒｅｓｐｏｎｓｅ邋ｒｅｇｕｌａｔｏｒ，ｏｍｐ／？）起著關(guān)鍵作用，通過全基因組測序發(fā)現(xiàn)ｏｗ／？／？基因在逡逑Ａ邐血ｙ邋ＭＴＨ－０４基因組中含有兩個拷貝，分別為0＃２０７和0的５９０，其在Ａ逡逑ｃＷ—？邋ＭＴＨ－０４基因組中的位置如圖２－１所示，且兩個ＯｍｐＲ蛋白氨基酸相似度逡逑為４１％邋（如圖２－２），另外通過ＢＬＡＳＴ發(fā)現(xiàn)0的５８９邋（Ａ邋ｃａ／血ｓ’邋ＭＴＨ－０４注釋為逡逑ｈｙｐｏｔｈｅｔｉｃａｌ邋ｐｒｏｔｅｉｎ）與ｃａ／ｔ／ｗｓ邋ＳＭ－１中ＥｎｖＺ蛋白序列完全相同，因此認為逡逑0＂２５８９是ｅｎｖＺ基因，為Ａ邋ｒａ／ｃ／奶邋ＭＴＨ－０４添加新的注釋，比對結(jié)果如圖２－３所逡逑示。通過在ＡｃａＷｗｓＭＴＨ－０４中實現(xiàn)0師尺基因的無痕敲除，并與野生型菌株相逡逑比較，對該基因的敲除將影響菌株生長代謝及其他基因的轉(zhuǎn)錄，因此，對Ａ邋ｃａ／Ｊｗ逡逑ＭＴＨ－０４中ｏ—進行敲除，有利于深入解析NB邋ｃｆｌ／血？邋ＭＴＨ－０４的代謝系統(tǒng)。逡逑根據(jù)本實驗室前期建立了邋Ａ邋ｃａＷｗ邋ＭＴＨ－０４基因的無痕敲除方法，基因無痕逡逑敲除方法的流程如圖２－４所示

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過菌落ＰＣＲ篩選單交換子，初步篩選到陽性單交換子后接種于液體培養(yǎng)基中擴逡逑大培養(yǎng)，提取基因組后使用ｏｒｉＴＲＰ４和同源臂兩種引物再次驗證單交換子。引物逡逑設(shè)計原理如圖２－７所示：逡逑」＾0７內(nèi)引＾邋ＣｏｌＥＩ邋ｏｒｉ邐物／Ｉ－Ｓｅｃ邋丨＿邋ｌｆ0７內(nèi)引物逡逑ｕｐ邐ｄｏｗｎ邐ＡｍｐＲ邋ｏｒｉＴ邋Ｋｍ邋ｕｐ邋ｄｏｗｎ逡逑—？邐u嚕義希掊危祝椋歟溴澹簦穡邋義希酰稹瑰危體澹洌錚鰨鑠義賢跡玻返ソ換蛔由稈∫鍔杓剖疽饌煎義希疲椋紓酰潁邋澹玻峰澹模椋幔紓潁幔礤澹錚駑澹穡潁椋恚澹蟈澹媯錚蟈澹螅悖潁澹澹睿椋睿玨澹螅椋睿紓歟邋澹悖潁錚螅螅錚觶澹蟈義險攵宰隕敝柿＃穡停模保梗錚潁椋裕耍恚停茫由咸賾械模錚潁椋藻澹遙校蔥蛄猩杓埔錚錚潁椋裕�、辶x希錚潁椋裕遙ü媯玻埃保常吧停鈴

本文編號：2758528