【摘要】：生物冶金技術(shù)在處理低品位、難開采礦石方面具有強(qiáng)大優(yōu)勢(shì),能從廢礦石、礦渣中有效浸出金屬,與傳統(tǒng)冶金工藝相比具有成本低、耗能少、環(huán)境污染小的優(yōu)點(diǎn)。為了提高我國(guó)礦產(chǎn)資源的有效利用率,必須構(gòu)建高效浸礦菌株,深入開展生物冶金技術(shù)的研究和應(yīng)用。生物浸礦過(guò)程中銅離子的不斷溶出積累,對(duì)冶金微生物產(chǎn)生毒害,導(dǎo)致生物冶金的效率降低,因此,構(gòu)建穩(wěn)定遺傳的高抗銅基因工程菌是提高生物冶金效率的有效手段。嗜酸性氧化亞鐵硫桿菌(Acidithiobacillus ferrooxidans,簡(jiǎn)稱A.ferrooxidans)是生物浸礦中的優(yōu)勢(shì)菌種,據(jù)報(bào)道該菌可以耐受高濃度的銅離子,是研究浸礦細(xì)菌銅抗性的好材料,但是,該菌在銅離子抗性方面的研究還不完善,僅有利用生物信息學(xué),蛋白組學(xué)以及轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究參照大腸桿菌推測(cè)的銅抗性模型,因此,深入研究模型中的銅抗性基因,不僅可以豐富完善該菌的銅抗性機(jī)制,還可為構(gòu)建高效抗銅菌株提供理論依據(jù)和實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。在嗜酸性氧化亞鐵硫桿菌銅抗性機(jī)制模型中有Cop系統(tǒng)、Cus系統(tǒng)、polyP系統(tǒng)以及一些銅離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白是該菌可以耐受很高銅離子的關(guān)鍵。其中Cop系統(tǒng)由三個(gè)預(yù)測(cè)的與銅離子轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)的P-ATPase組成,其編碼基因分別是AFE_2779(copA1)、AFE_2439(copA2)、AFE_2021(copB)。有一些文獻(xiàn)中已經(jīng)報(bào)道將copA1和copB基因分別在大腸桿菌銅抗性缺陷株中異源表達(dá),可提高缺陷株的銅抗性,但是CopA1和CopB在極端嗜酸性A.ferrooxidans銅抗性中的功能尚不確定。分析本實(shí)驗(yàn)室關(guān)于A.ferrooxidans銅抗性的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù),也發(fā)現(xiàn)在銅離子刺激下copA1、copB上調(diào)比較高,因此,本文選取A.ferrooxidans銅抗性Cop系統(tǒng)中的copA1和copB進(jìn)行研究,探究CopAl和CopB在極端嗜酸性A.ferrooxidans銅抗性中的作用�；蚯贸腔蚬δ苎芯康挠行侄�,為了研究copA1和copB這兩個(gè)基因在嗜酸性氧化亞鐵硫桿菌在銅抗性方面的作用,本文采用本實(shí)驗(yàn)室建立的無(wú)標(biāo)記基因敲除方法對(duì)這兩個(gè)基因分別進(jìn)行了敲除。首先根據(jù)NCBI上d.ferrooxidans ATCC 23270基因組上兩基因的序列分別設(shè)計(jì)了引物,擴(kuò)增了基因的上游同源臂和下游同源臂,分別連接到pUC19質(zhì)粒上進(jìn)行測(cè)序;并將測(cè)序正確的序列亞克隆到敲除質(zhì)粒pK19上,構(gòu)建了兩基因的敲除質(zhì)粒pK19-copA1和pK19-copB。然后,分別將兩個(gè)敲除質(zhì)粒采用接合轉(zhuǎn)移的方法轉(zhuǎn)到宿主菌A.ferrooxians ATCC 23270中,利用卡那霉素抗性篩選獲得敲除質(zhì)粒整合至A.ferrooxidan 基因組上的單交換子;進(jìn)一步將含有酵母限制性內(nèi)切酶編碼基因的重組質(zhì)粒pMSD1-I-Scel導(dǎo)入單交換子中,誘導(dǎo)單交換子發(fā)生第二次同源重組,通過(guò)篩選成功獲得copA1、copB基因分別敲除的突變株A.ferrooxidans ΔcopA1和A1和A.ferrooxidans ΔcopB,為研究copA1和copB基因在該菌銅抗性中的功能提供了實(shí)驗(yàn)材料。在成功構(gòu)建A.ferrooxidans ΔcopA1和A.ferrooxidans △copB兩個(gè)基因敲除突變株的基礎(chǔ)上,以A.ferrooxidans ATCC 23270野生型為對(duì)照,分別測(cè)定了敲除突變株以硫粉為能源時(shí)的生長(zhǎng)曲線和以亞鐵為能源時(shí)的亞鐵氧化曲線,結(jié)果顯示copA1、copB這兩個(gè)基因的單獨(dú)敲除僅在一定程度上降低了該菌的抗銅性質(zhì),并沒有使A.ferrooxidans完全喪失抵抗銅離子的性質(zhì)。又采用RT-qPCR方法分析了突變株中與銅抗性相關(guān)基因的差異性表達(dá),結(jié)果顯示在以亞鐵為能源時(shí)比以硫粉為能源時(shí)顯示差異表達(dá)的基因多,在兩個(gè)敲除菌中都上調(diào)的基因有copC、copZ和ompA,都顯著下調(diào)的基因是omp40,只在copA基因敲除后ppK1、ppK2和cusA也有明顯的上調(diào)。以上結(jié)果說(shuō)明A.ferrooxidans菌株的抗銅特性由多個(gè)抗銅系統(tǒng)同時(shí)發(fā)揮作用,一個(gè)抗銅系統(tǒng)受損可通過(guò)增強(qiáng)其他抗銅系統(tǒng)彌補(bǔ)。綜上,本文通過(guò)構(gòu)建A.ferrooxidans ΔcopA1和ΔcopB基因敲除突變株、測(cè)定敲除突變株的抗銅性質(zhì)及分析銅抗性基因的差異表達(dá),發(fā)現(xiàn)在A.ferrooxidans銅抗性機(jī)制中,Cop系統(tǒng)、Cus系統(tǒng)、polyP系統(tǒng)以及omp40、tonB和ompA編碼的外膜蛋白都發(fā)揮一定的作用,Cop抗銅系統(tǒng)受損可通過(guò)增強(qiáng)其他抗銅系統(tǒng)彌補(bǔ),由于沒有同時(shí)敲除Cop系統(tǒng)所有基因,尚需進(jìn)一步研究才能評(píng)價(jià)Cop系統(tǒng)在該菌銅抗性中的地位。本文構(gòu)建的copA1和copB基因敲除突變株為研究這兩個(gè)基因在A.ferrooxidans銅抗性中的作用提供了直接的實(shí)驗(yàn)材料。
【圖文】：

浸礦微生物生活環(huán)境金屬離子濃度過(guò)高時(shí)，就會(huì)激活自身相關(guān)基因的表達(dá)，逡逑維持胞內(nèi)的金屬離子維持在安全范圍內(nèi)。主要的機(jī)制：細(xì)胞胞外吸附、外排作用、逡逑細(xì)胞的胞內(nèi)或胞外螯合、酶轉(zhuǎn)化、降低細(xì)胞靶目標(biāo)的敏感性（如圖１．１所示）。逡逑Ａｓ（ｌｌｌ）逡逑Ｈ９邋0）逡逑／邐＞＾＾Ｈｇ（０）邐Ｅｆｆｌｕｘ逡逑ｆ邋，邐＼邐Ｉ邋ｎｔｒａ／Ｅｘｔｒａ－邐＼逡逑／邐／邋Ｅｎｚｙｍａｔｉｃ＾邐ｃｅｌＭａ「ｂｉｎｄｉｎｇ邋＼邐＼逡逑Ｉ邋Ｉ邋ｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ邋■邐Ｐ（ｙ）邋｜邐｜逡逑＼邐＼邋Ｈｇ（ｌｌ）邐Ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｔｙ邐／逡逑ＣｒＷ．邋Ｒ－Ｃ？？逡逑ｅｎｖｅｌｏｐｅ邐＾＾ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ邋ａ邐ＪｒＡｓ（Ｖ）逡逑圖１．１浸礦微生物金屬抗性機(jī)制模式圖（Ｄｏｐｓｏｎｄ？／．，２００３）逡逑Ｆｉｇ．邋１．１邋Ｓｃｈｅｍａｔｉｃ邋ｄｉａｇｒａｍ邋ｏｆ邋ｍｅｔａｌ邋ｔｏｌｅｒａｎｃｅ邋ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ邋ｉｎ邋ｂｉｏｌｅａｃｈｉｎｇ逡逑ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ．逡逑（Ｉ）胞外吸附。胞外吸附是構(gòu)成微生物金屬抗性的第一道防線。微生物通逡逑過(guò)生物膜中的胞外多聚物（ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ邋ｐｏｌｙｍｅｒｉｃ邋ｓｕｂｓｔａｎｃｅｓ，邋ＥＰＳ）與金屬離子之逡逑間建立共價(jià)連接和靜電相互作用，達(dá)到胞外吸附金屬離子的目的，減少金屬離子逡逑向胞內(nèi)的運(yùn)輸（Ｋａｐｌａｎ邋以邋ａ／．，１９８７；邋Ｋｉｍ邋ｅ／邋0／＿，１９９６；邋Ｔｅｉｔｚｅｌ邋ａｎｄ邋Ｐａｒｓｅｋ，２００３：逡逑Ｗｅｎｂｉｎ邋ｅｔ邋ａ／．

圖１．５邋Ａ／ｅｒｒａｏｊｃ／ｔ／樷ｓ’ＡＴＣＣ邋２３２７０的銅抗性機(jī)制模型逡逑Ｆｉｇ．邋１．５Ｍｏｄｅｌ邋ｏｆ邋ｃｏｐｐｅｒ邋ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ邋ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ邋ｉｎ邋Ａ．邋ｆｅｒｒｏｏｘｉｄａｎｓ邋ＡＴＣＣ邋２３２７０逡逑（Ａｌｍａｒｃｅｇｕｉ邋ｅｔ邋ａｌ．，邋２０１４）逡逑１．５本文的研究目的和研究?jī)?nèi)容逡逑隨著礦產(chǎn)資源的不斷開發(fā)利用，我國(guó)的尾礦貧礦日益增多，，生物冶金技術(shù)相逡逑比與傳統(tǒng)冶金工業(yè)有節(jié)能、環(huán)境友好等諸多優(yōu)勢(shì)，應(yīng)用該方法進(jìn)行礦產(chǎn)資源的開逡逑發(fā)是解決該問題的有效途徑。由于生物冶金效率受到很多環(huán)境因素的影響，其中，逡逑浸礦環(huán)境中急劇升高的銅離子濃度是制約生物冶金效率的重要因素之一。因此，逡逑通過(guò)對(duì)浸礦微生物銅抗性機(jī)制的研究不僅能為浸礦微生物的銅抗性定向遺傳改逡逑造提供靶點(diǎn)，而且將豐富完善己知的微生物銅抗性機(jī)制。逡逑在微生物銅抗性機(jī)制方面研究最清楚的是大腸桿菌，大腸桿菌最高銅離子耐逡逑受濃度僅７．０邋ｍＭ邋（Ｌｅｅ邋ｄ邋ａ／．，２００２）。而嗜酸性氧化亞鐵硫桿菌普通菌株經(jīng)過(guò)馴化逡逑
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：TF18;Q939.97

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本文編號(hào)：2690702