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嗜酸性氧化亞鐵硫桿菌基于Cop系統(tǒng)的抗銅機(jī)制研究

發(fā)布時間:2020-06-01 00:41
【摘要】:生物冶金技術(shù)在處理低品位、難開采礦石方面具有強大優(yōu)勢,能從廢礦石、礦渣中有效浸出金屬,與傳統(tǒng)冶金工藝相比具有成本低、耗能少、環(huán)境污染小的優(yōu)點。為了提高我國礦產(chǎn)資源的有效利用率,必須構(gòu)建高效浸礦菌株,深入開展生物冶金技術(shù)的研究和應(yīng)用。生物浸礦過程中銅離子的不斷溶出積累,對冶金微生物產(chǎn)生毒害,導(dǎo)致生物冶金的效率降低,因此,構(gòu)建穩(wěn)定遺傳的高抗銅基因工程菌是提高生物冶金效率的有效手段。嗜酸性氧化亞鐵硫桿菌(Acidithiobacillus ferrooxidans,簡稱A.ferrooxidans)是生物浸礦中的優(yōu)勢菌種,據(jù)報道該菌可以耐受高濃度的銅離子,是研究浸礦細(xì)菌銅抗性的好材料,但是,該菌在銅離子抗性方面的研究還不完善,僅有利用生物信息學(xué),蛋白組學(xué)以及轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究參照大腸桿菌推測的銅抗性模型,因此,深入研究模型中的銅抗性基因,不僅可以豐富完善該菌的銅抗性機(jī)制,還可為構(gòu)建高效抗銅菌株提供理論依據(jù)和實驗數(shù)據(jù)。在嗜酸性氧化亞鐵硫桿菌銅抗性機(jī)制模型中有Cop系統(tǒng)、Cus系統(tǒng)、polyP系統(tǒng)以及一些銅離子轉(zhuǎn)運蛋白是該菌可以耐受很高銅離子的關(guān)鍵。其中Cop系統(tǒng)由三個預(yù)測的與銅離子轉(zhuǎn)運相關(guān)的P-ATPase組成,其編碼基因分別是AFE_2779(copA1)、AFE_2439(copA2)、AFE_2021(copB)。有一些文獻(xiàn)中已經(jīng)報道將copA1和copB基因分別在大腸桿菌銅抗性缺陷株中異源表達(dá),可提高缺陷株的銅抗性,但是CopA1和CopB在極端嗜酸性A.ferrooxidans銅抗性中的功能尚不確定。分析本實驗室關(guān)于A.ferrooxidans銅抗性的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù),也發(fā)現(xiàn)在銅離子刺激下copA1、copB上調(diào)比較高,因此,本文選取A.ferrooxidans銅抗性Cop系統(tǒng)中的copA1和copB進(jìn)行研究,探究CopAl和CopB在極端嗜酸性A.ferrooxidans銅抗性中的作用�;蚯贸腔蚬δ苎芯康挠行侄�,為了研究copA1和copB這兩個基因在嗜酸性氧化亞鐵硫桿菌在銅抗性方面的作用,本文采用本實驗室建立的無標(biāo)記基因敲除方法對這兩個基因分別進(jìn)行了敲除。首先根據(jù)NCBI上d.ferrooxidans ATCC 23270基因組上兩基因的序列分別設(shè)計了引物,擴(kuò)增了基因的上游同源臂和下游同源臂,分別連接到pUC19質(zhì)粒上進(jìn)行測序;并將測序正確的序列亞克隆到敲除質(zhì)粒pK19上,構(gòu)建了兩基因的敲除質(zhì)粒pK19-copA1和pK19-copB。然后,分別將兩個敲除質(zhì)粒采用接合轉(zhuǎn)移的方法轉(zhuǎn)到宿主菌A.ferrooxians ATCC 23270中,利用卡那霉素抗性篩選獲得敲除質(zhì)粒整合至A.ferrooxidan 基因組上的單交換子;進(jìn)一步將含有酵母限制性內(nèi)切酶編碼基因的重組質(zhì)粒pMSD1-I-Scel導(dǎo)入單交換子中,誘導(dǎo)單交換子發(fā)生第二次同源重組,通過篩選成功獲得copA1、copB基因分別敲除的突變株A.ferrooxidans ΔcopA1和A1和A.ferrooxidans ΔcopB,為研究copA1和copB基因在該菌銅抗性中的功能提供了實驗材料。在成功構(gòu)建A.ferrooxidans ΔcopA1和A.ferrooxidans △copB兩個基因敲除突變株的基礎(chǔ)上,以A.ferrooxidans ATCC 23270野生型為對照,分別測定了敲除突變株以硫粉為能源時的生長曲線和以亞鐵為能源時的亞鐵氧化曲線,結(jié)果顯示copA1、copB這兩個基因的單獨敲除僅在一定程度上降低了該菌的抗銅性質(zhì),并沒有使A.ferrooxidans完全喪失抵抗銅離子的性質(zhì)。又采用RT-qPCR方法分析了突變株中與銅抗性相關(guān)基因的差異性表達(dá),結(jié)果顯示在以亞鐵為能源時比以硫粉為能源時顯示差異表達(dá)的基因多,在兩個敲除菌中都上調(diào)的基因有copC、copZ和ompA,都顯著下調(diào)的基因是omp40,只在copA基因敲除后ppK1、ppK2和cusA也有明顯的上調(diào)。以上結(jié)果說明A.ferrooxidans菌株的抗銅特性由多個抗銅系統(tǒng)同時發(fā)揮作用,一個抗銅系統(tǒng)受損可通過增強其他抗銅系統(tǒng)彌補。綜上,本文通過構(gòu)建A.ferrooxidans ΔcopA1和ΔcopB基因敲除突變株、測定敲除突變株的抗銅性質(zhì)及分析銅抗性基因的差異表達(dá),發(fā)現(xiàn)在A.ferrooxidans銅抗性機(jī)制中,Cop系統(tǒng)、Cus系統(tǒng)、polyP系統(tǒng)以及omp40、tonB和ompA編碼的外膜蛋白都發(fā)揮一定的作用,Cop抗銅系統(tǒng)受損可通過增強其他抗銅系統(tǒng)彌補,由于沒有同時敲除Cop系統(tǒng)所有基因,尚需進(jìn)一步研究才能評價Cop系統(tǒng)在該菌銅抗性中的地位。本文構(gòu)建的copA1和copB基因敲除突變株為研究這兩個基因在A.ferrooxidans銅抗性中的作用提供了直接的實驗材料。
【圖文】:

模式圖,浸礦微生物,模式圖,機(jī)制


浸礦微生物生活環(huán)境金屬離子濃度過高時,就會激活自身相關(guān)基因的表達(dá),逡逑維持胞內(nèi)的金屬離子維持在安全范圍內(nèi)。主要的機(jī)制:細(xì)胞胞外吸附、外排作用、逡逑細(xì)胞的胞內(nèi)或胞外螯合、酶轉(zhuǎn)化、降低細(xì)胞靶目標(biāo)的敏感性(如圖1.1所示)。逡逑As(lll)逡逑H9邋0)逡逑/邐>^^Hg(0)邐Efflux逡逑f邋,邐\邐I邋ntra/Extra-邐\逡逑/邐/邋Enzymatic^邐celMa「binding邋\邐\逡逑I邋I邋conversion邋■邐P(y)邋|邐|逡逑\邐\邋Hg(ll)邐Permeability邐/逡逑CrW.邋R-C??逡逑envelope邐^^sensitivity邋a邐JrAs(V)逡逑圖1.1浸礦微生物金屬抗性機(jī)制模式圖(Dopsond?/.,2003)逡逑Fig.邋1.1邋Schematic邋diagram邋of邋metal邋tolerance邋mechanisms邋in邋bioleaching逡逑microorganisms.逡逑(I)胞外吸附。胞外吸附是構(gòu)成微生物金屬抗性的第一道防線。微生物通逡逑過生物膜中的胞外多聚物(extracellular邋polymeric邋substances,邋EPS)與金屬離子之逡逑間建立共價連接和靜電相互作用,達(dá)到胞外吸附金屬離子的目的,減少金屬離子逡逑向胞內(nèi)的運輸(Kaplan邋以邋a/.,1987;邋Kim邋e/邋0/_,1996;邋Teitzel邋and邋Parsek,2003:逡逑Wenbin邋et邋a/.

模型圖,抗性機(jī)制,模型,生物冶金


圖1.5邋A/erraojc/t/樷s’ATCC邋23270的銅抗性機(jī)制模型逡逑Fig.邋1.5Model邋of邋copper邋resistance邋mechanisms邋in邋A.邋ferrooxidans邋ATCC邋23270逡逑(Almarcegui邋et邋al.,邋2014)逡逑1.5本文的研究目的和研究內(nèi)容逡逑隨著礦產(chǎn)資源的不斷開發(fā)利用,我國的尾礦貧礦日益增多,,生物冶金技術(shù)相逡逑比與傳統(tǒng)冶金工業(yè)有節(jié)能、環(huán)境友好等諸多優(yōu)勢,應(yīng)用該方法進(jìn)行礦產(chǎn)資源的開逡逑發(fā)是解決該問題的有效途徑。由于生物冶金效率受到很多環(huán)境因素的影響,其中,逡逑浸礦環(huán)境中急劇升高的銅離子濃度是制約生物冶金效率的重要因素之一。因此,逡逑通過對浸礦微生物銅抗性機(jī)制的研究不僅能為浸礦微生物的銅抗性定向遺傳改逡逑造提供靶點,而且將豐富完善己知的微生物銅抗性機(jī)制。逡逑在微生物銅抗性機(jī)制方面研究最清楚的是大腸桿菌,大腸桿菌最高銅離子耐逡逑受濃度僅7.0邋mM邋(Lee邋d邋a/.,2002)。而嗜酸性氧化亞鐵硫桿菌普通菌株經(jīng)過馴化逡逑
【學(xué)位授予單位】:山東大學(xué)
【學(xué)位級別】:碩士
【學(xué)位授予年份】:2019
【分類號】:TF18;Q939.97

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本文編號:2690702

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