生物制氫技術(shù)以其常溫、常壓、能耗低、環(huán)保等特性,已經(jīng)引起各國科學(xué)家的高度重視。在目前備受關(guān)注的幾種生物制氫方法中,以廢棄生物質(zhì)為底物的發(fā)酵法生物制氫,是更接近實用技術(shù)的方法。近年來的研究結(jié)果表明,暗發(fā)酵與光發(fā)酵產(chǎn)H_2在底物利用方面具有很好的互補性,暗-光發(fā)酵耦聯(lián)制氫技術(shù)不僅可以提高底物向產(chǎn)氫的轉(zhuǎn)化效率,還可以達到發(fā)酵液上清直接排放的清潔標準,為生物質(zhì)向氫能的轉(zhuǎn)化提供了一種理想的清潔生產(chǎn)途徑。本論文以進一步提高暗、光發(fā)酵法制氫的效率為研究目標,在混合菌群暗發(fā)酵過程中微生物組成與產(chǎn)H_2效率關(guān)系的解析、高效產(chǎn)H_2菌株的篩選與產(chǎn)H_2條件的優(yōu)化以及利用自然光的光發(fā)酵制氫等方面展開了研究。具體研究內(nèi)容包括以下五個部分: 1.利用不同底物進行暗-光耦聯(lián)兩步法生物制氫的研究。針對尋找合適原料這一開發(fā)生物能源面臨的重要問題,選擇能源作物木薯(Manihot esculenta Crantz)和廢棄物廚余垃圾為底物,進行暗-光耦聯(lián)兩步法生物制氫的可行性研究。通過暗發(fā)酵產(chǎn)H_2,木薯、廚余垃圾及對照蔗糖三種底物產(chǎn)H_2量分別為212,226和223 mL/g-底物。再通過類球紅細菌(Rhodobacter sphaeroides)ZX-5利用三組暗發(fā)酵液厭氧光照產(chǎn)H_2,產(chǎn)H_2量分別達到611±11 mL/g、451±20 mL/g和565±13 mL/g。通過暗-光耦聯(lián)兩步法產(chǎn)H_2,產(chǎn)H_2量比僅暗發(fā)酵高出2-3倍,并且發(fā)酵液COD去除率達80%以上。結(jié)果表明,木薯粉和廚余垃圾是暗-光耦聯(lián)兩步法生物制氫理想的生物質(zhì)資源,所建立的暗光耦聯(lián)兩步法產(chǎn)H_2體系,不僅可以把包括廢棄物在內(nèi)的生物質(zhì)等更加徹底地轉(zhuǎn)化成清潔能源氫氣,同時也避免了暗發(fā)酵產(chǎn)生的有機酸所帶來的環(huán)境污染。 2.解析10L連續(xù)攪拌式罐式反應(yīng)器(CSTR)暗發(fā)酵產(chǎn)H_2過程中優(yōu)勢微生物的演替規(guī)律。通過變性梯度凝膠電泳(DGGE)分析16S-rRNA組成的多態(tài)并測序分析相關(guān)DGGE條帶,以及采用實時定量PCR(qrt-PCR)和基于鐵氫酶hydA的DNA及cDNA克隆建庫等技術(shù)解析系統(tǒng)菌群結(jié)構(gòu)與產(chǎn)H_2效率之間的關(guān)系。分析結(jié)果表明:從接種到產(chǎn)H_2結(jié)束的不同時期,系統(tǒng)中優(yōu)勢菌群存在明顯的演替,產(chǎn)H_2前期為好氧的芽胞桿菌(Bacillus),產(chǎn)H_2初期開始出現(xiàn)拜氏梭菌(Clostridium beijerinckii),而產(chǎn)H_2旺期以拜氏梭菌和產(chǎn)氣莢膜梭菌(Clostridium perfringens)為優(yōu)勢菌,產(chǎn)H_2末期又逐漸出現(xiàn)了另一些能夠利用蛋白的梭菌,而且反應(yīng)器中氧化還原電位(ORP)的變化與優(yōu)勢菌群的演替及產(chǎn)H_2速率一致�；趆ydA基因構(gòu)建的DNA和cDNA文庫,得到一個反映不同時期產(chǎn)H_2菌種類和豐度的動態(tài)變化圖。通過qrt-PCR研究不同時段hydA基因的表達,發(fā)現(xiàn)系統(tǒng)中總hydA的表達水平在穩(wěn)定期達到峰值,而單位產(chǎn)H_2菌的相對hydAmRNA表達水平卻在指數(shù)期達到峰值。上述結(jié)果表明采用分子生態(tài)學(xué)技術(shù)能有效地監(jiān)測產(chǎn)H_2系統(tǒng)中混合菌群的優(yōu)勢種群及其動態(tài)演替規(guī)律。 3.從暗發(fā)酵產(chǎn)H_2系統(tǒng)中分離產(chǎn)H_2功能菌。在解析暗發(fā)酵產(chǎn)H_2系統(tǒng)中微生物演替規(guī)律的基礎(chǔ)上,針對不同產(chǎn)H_2階段的優(yōu)勢菌設(shè)計分離方案。從運行8h的10LCSTR所采集的樣品中分離純化出08-2優(yōu)勢菌株,經(jīng)16S rRNA基因序列鑒定,為蠟質(zhì)芽孢桿菌(Bacillus cereus)。從運行16 h的10 L CSTR所采集的樣品中分離純化出14株產(chǎn)H_2菌菌株。并通過基于ERIC(腸桿菌基因間共有多重序列)-PCR技術(shù)將14株菌快速鑒別為3種不同的菌株。其中08-1菌株通過形態(tài)特征和分子生物學(xué)鑒定,初步鑒定為Clostridiumbeijerinckii。對該菌株的產(chǎn)H_2性能進行研究,發(fā)現(xiàn)同葡萄糖相比,該菌株更適宜利用蔗糖、生物質(zhì)木薯粉以及成分更為復(fù)雜的廚余垃圾生長及產(chǎn)H_2。在間歇發(fā)酵中,實現(xiàn)最大產(chǎn)H_2速率為245 mL H_2/(L·h),產(chǎn)H_2量達到3.09 mol-H_2/(mol-蔗糖)。而08-11菌株是能夠產(chǎn)H_2的兼性厭氧菌,與親緣關(guān)系最近的地衣芽孢桿菌菌株(Bacillus lichenformisAnBa7)相似度為95%,因此,該菌株可初步判斷為桿菌中的一個新種。對10L CSTR運行24 h階段采集的樣品用選擇性培養(yǎng)基分離出能夠快速生長并產(chǎn)H_2的產(chǎn)氣莢膜梭菌(Clostridium perfringens)08-31。另外,從其他產(chǎn)H_2系統(tǒng)中分離獲得產(chǎn)H_2菌株128株,通過ERIC-PCR及16S rRNA基因序列分析,獲得丁酸梭菌5株,腸細菌屬(Enterobacter)3株,產(chǎn)氣莢膜梭菌,拜氏梭菌,地衣芽孢桿菌和凝結(jié)芽孢桿菌各1株。結(jié)果表明,從10 L CSTR反應(yīng)器中成功分離出多株菌株,進一步證實了基于分子標記的監(jiān)測系統(tǒng)預(yù)測菌群結(jié)構(gòu)的有效性;另外,首次將ERIC-PCR技術(shù)成功地用于暗發(fā)酵產(chǎn)H_2菌株的快速鑒別。 4.分離與篩選光合產(chǎn)H_2菌株。從不同廢水中分離純化出13株光合細菌,以30mM蘋果酸為底物進行產(chǎn)H_2能力研究,發(fā)現(xiàn)最大產(chǎn)H_2速率為47-103 mL/(L·h),底物轉(zhuǎn)化效率為27.98-72.00%。從中挑出4株產(chǎn)H_2能力較好的菌株,分別以乙酸和丁酸做碳源進行光發(fā)酵產(chǎn)H_2試驗,其中HL-1菌株能利用這兩種碳源生長并產(chǎn)H_2;SC-6和SC-7菌株不能利用這兩種碳源產(chǎn)H_2;HL-5菌株在乙酸培養(yǎng)基中能生長但不產(chǎn)氣,在丁酸培養(yǎng)基中能生長并產(chǎn)H_2。這些菌株的獲得,對于研究光合細菌乙酸和丁酸代謝途徑提供了極好的材料。另外,從37株光合細菌中篩選出一株能夠利用甘油為碳源進行有效產(chǎn)H_2的菌株。根據(jù)菌株的形態(tài)、生理生化特征、16S rDNA序列和ERIC-PCR結(jié)果分析,初步鑒定DB803菌株為Rhodobacter sphaeroides,同時也研究了DB803菌株在30℃,4000 lux光照厭氧條件下利用不同濃度的生物柴油生產(chǎn)廢水產(chǎn)H_2能力,當培養(yǎng)基中起始COD值為11.5g/L時,其在對數(shù)生長期平均產(chǎn)H_2速度為38 mL/(L·h),同時,廢水COD去除率達91.2%,結(jié)果表明該菌株在生物柴油生產(chǎn)廢水的處理及利用其進行生物產(chǎn)H_2中具有潛在的應(yīng)用價值。此外,不同的類球紅細菌菌株利用甘油產(chǎn)H_2能力的差異顯著,篩選出的DB803菌株為進一步研究光合細菌利用甘油產(chǎn)H_2的代謝途徑提供了材料。 5.優(yōu)化光發(fā)酵產(chǎn)H_2條件及初步研究自然光光發(fā)酵產(chǎn)H_2。在光合產(chǎn)H_2實驗中,通過設(shè)置兩種條件下制成的接種物和三種裝液量,發(fā)現(xiàn)光照厭氧種子產(chǎn)H_2性能優(yōu)于黑暗好氧種子;反應(yīng)器頂部空間小的其底物轉(zhuǎn)化效率高;頂部空間填充氮氣可能促進光合細菌菌體的代謝活性。另外,還研究了太陽光對6 L光發(fā)酵制氫系統(tǒng)的影響,在白天利用戶外太陽輻射能晚上進行人工補光的產(chǎn)H_2實驗中,光合細菌的產(chǎn)H_2速度與陽光光強成正比,白天和晚上的平均產(chǎn)H_2速率分別為12.4 mL/(L·h)和9.0 mL/(L·h),整個試驗的底物轉(zhuǎn)化效率達72.4%,與之對應(yīng)的一次實驗,即白天利用陽光晚上不補光的試驗組,底物轉(zhuǎn)化效率為45.02%。光反應(yīng)器體積放大后,產(chǎn)H_2時間的延長是徑高比值大的柱狀反應(yīng)器其比表面積小所致。
【學(xué)位單位】：安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位年份】：2009
【中圖分類】：TK6
【文章目錄】：
中文摘要
英文摘要
目錄
插圖和附表清單
主要縮略詞和符號表
第1章 文獻綜述
    1.1 生物制氫概述
        1.1.1 生物制氫的意義
        1.1.2 生物制氫的類型
    1.2 光解水產(chǎn)氫的研究現(xiàn)狀及其進展
    1.3 暗發(fā)酵產(chǎn)氫的研究現(xiàn)狀及其進展
        1.3.1 暗發(fā)酵產(chǎn)氫的底物
        1.3.2 暗發(fā)酵產(chǎn)氫的微生物種類
        1.3.3 暗發(fā)酵產(chǎn)氫的機理
        1.3.4 影響暗發(fā)酵產(chǎn)氫的主要環(huán)境因子
        1.3.5 暗發(fā)酵產(chǎn)氫的反應(yīng)器類型
    1.4 光合產(chǎn)氫研究現(xiàn)狀及其進展
        1.4.1 光合產(chǎn)氫的底物
        1.4.2 光合產(chǎn)氫的微生物種類
        1.4.3 光合細菌產(chǎn)氫的機理
        1.4.4 光合細菌產(chǎn)氫主要影響因素
        1.4.5 光合產(chǎn)氫的反應(yīng)器類型
    1.5 暗-光聯(lián)合產(chǎn)氫研究現(xiàn)狀及其進展
        1.5.1 發(fā)酵細菌和光合細菌共培養(yǎng)產(chǎn)氫
        1.5.2 暗-光兩步法產(chǎn)氫
    1.6 生物制氫研究面臨的問題
        1.6.1 接種物
        1.6.2 反應(yīng)器的設(shè)計和運行調(diào)控
        1.6.3 產(chǎn)氫系統(tǒng)的快速檢測與預(yù)測系統(tǒng)
        1.6.4 降低生物制氫成本
第2章 引言
    2.1 課題來源
    2.2 研究的目的和意義
    2.3 本論文的主要研究內(nèi)容
第3章 暗-光耦聯(lián)兩步法生產(chǎn)生物氫氣的研究
    3.1 材料與方法
        3.1.1 材料
        3.1.2 方法
    3.2 結(jié)果與分析
        3.2.1 暗發(fā)酵產(chǎn)氫
        3.2.2 類球紅細菌利用暗發(fā)酵液厭氧光照產(chǎn)氫
        3.2.3 暗-光耦聯(lián)兩步法產(chǎn)氫總量及發(fā)酵液COD的去除率
    3.3 討論
    3.4 結(jié)論
第4章 10L CSTR暗發(fā)酵產(chǎn)氫系統(tǒng)菌群結(jié)構(gòu)與功能關(guān)系解析
    4.1 材料與方法
        4.1.1 接種物與培養(yǎng)基
        4.1.2 反應(yīng)器及參數(shù)控制
        4.1.3 化學(xué)分析
        4.1.4 核酸抽提
        4.1.5 反轉(zhuǎn)錄RNA及PCR擴增
        4.1.6 變性梯度凝膠電泳（denatured gradient gel electrophoresis,DGGE）分析
        4.1.7 構(gòu)建克隆文庫與測序
        4.1.8 實時定量PCR（qrt-PCR）
    4.2 結(jié)果與分析
        4.2.1 10L CSTR反應(yīng)器產(chǎn)氫情況
        4.2.2 系統(tǒng)中總菌和產(chǎn)氫菌的定量
        4.2.3 DGGE研究生物制氫反應(yīng)器中微生物群落演替
        4.2.4 基于鐵氫酶克隆文庫研究產(chǎn)氫菌的菌群動態(tài)變化
        4.2.5 厭氧發(fā)酵系統(tǒng)中鐵氫酶基因的表達
    4.3 討論
        4.3.1 接種物預(yù)處理對微生物構(gòu)成的影響
        4.3.2 耦聯(lián)使用16S-rRNA和鐵氫酶hydA基因兩種分子標記的優(yōu)勢
        4.3.3 系統(tǒng)中菌群演替的驅(qū)動力的探討
    4.4 結(jié)論
第5章 產(chǎn)氫系統(tǒng)中重要功能菌的篩選
    5.1 材料與方法
        5.1.1 材料
        5.1.2 實驗方法
    5.2 結(jié)果與分析
        5.2.1 菌株08-1的分離鑒定
        5.2.2 菌株08-2的分離鑒定
        5.2.3 菌株08-11的分離鑒定
        5.2.4 產(chǎn)氣莢膜梭菌的計數(shù)、分離及分子鑒定
        5.2.5 從其他產(chǎn)氫系統(tǒng)中分離的產(chǎn)氫菌株及分子鑒定
    5.3 討論
        5.3.1 證實基于分子標記的產(chǎn)氫群落監(jiān)測系統(tǒng)的有效性
        5.3.2 ERIC-PCR技術(shù)在純菌初篩中的應(yīng)用
    5.4 結(jié)論
第6章 光合細菌的分離及篩選
    6.1 材料與方法
        6.1.1 材料
        6.1.2 方法
    6.2 結(jié)果與分析
        6.2.1 13株光合細菌菌株產(chǎn)氫能力比較
        6.2.2 光合細菌利用乙酸和丁酸為碳源產(chǎn)氫
        6.2.3 利用甘油產(chǎn)氫的光合細菌篩選
        6.2.4 菌株DB803鑒定
    6.3 結(jié)論
第7章 光合細菌利用太陽能放大產(chǎn)氫的初步研究
    7.1 材料與方法
        7.1.1 材料
        7.1.2 實驗方法
    7.2 結(jié)果與分析
        7.2.1 不同接種物和不同裝液量對光發(fā)酵產(chǎn)氫的影響
        7.2.2 反應(yīng)器頂部空間氣體對光發(fā)酵產(chǎn)氫的影響
        7.2.3 戶外光發(fā)酵產(chǎn)氫初步研究
    7.3 討論
    7.4 結(jié)論
創(chuàng)新點
參考文獻
實驗主要儀器設(shè)備及試劑
致謝
作者簡介
攻讀博士學(xué)位期間發(fā)表和待發(fā)表的學(xué)術(shù)論文、摘要

【引證文獻】

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前1條

1 王艷霞;木質(zhì)素分解復(fù)合菌系的篩選及其在生物機械制漿技術(shù)中的應(yīng)用[D];黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué);2013年

本文編號：2881673