沼氣發(fā)酵生態(tài)系統(tǒng)的復(fù)雜性與獨(dú)特性決定了其中微生物的多樣性及基因資源的珍稀性,深入開展農(nóng)村戶用沼氣池發(fā)酵微生物的研究將加快農(nóng)村沼氣工藝的發(fā)展進(jìn)程。本論文系統(tǒng)開展了農(nóng)村戶用沼氣池污泥微生物總DNA提取方法的研究；建立了農(nóng)村戶用沼氣池污泥微生物16S rRNA基因V3區(qū)PCR-DGGE分析平臺；開展了農(nóng)村戶用沼氣池污泥樣品中mcrA功能基因多樣性研究。獲得了如下主要研究結(jié)果與結(jié)論： 首先,采用化學(xué)裂解法、溶菌酶裂解法和QIAamp DNA Stool Mini Kit提取了沼氣池污泥樣品中微生物的總DNA,對三種方法的DNA得率、純度、大片段提取效果以及是否含有PCR反應(yīng)抑制劑進(jìn)行了研究,最后對16S rRNA基因V3區(qū)的擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行了PCR變性梯度凝膠電泳(PCR-DGGE)分析。與化學(xué)裂解法和QIAamp DNA Stool Mini Kit法相比,溶菌酶裂解法得到的DNA量大,片段長,片段分布廣,PCR擴(kuò)增效率高；同時(shí)PCR-DGGE圖譜顯示,溶菌酶裂解法可更好地展示沼氣池污泥中微生物的多樣性。 其次,通過對PCR-DGGE條件的優(yōu)化,建立了農(nóng)村戶用沼氣池污泥微生物16S rRNA基因V3區(qū)PCR-DGGE分析平臺。通過PCR-DGGE技術(shù)分析了沼氣池污泥中細(xì)菌和古菌微生物多樣性隨沼氣池深度的變化規(guī)律,結(jié)果表明農(nóng)村戶用沼氣池污泥中含有豐富的微生物資源,其中細(xì)菌群落受污泥深度因素影響小,而淺層污泥中古菌群落與深層污泥中古菌群落卻存在明顯差別。 最后,通過構(gòu)建污泥樣品mcrA功能基因克隆文庫,應(yīng)用RFLP技術(shù),開展了農(nóng)村戶用沼氣池污泥樣品中與次級代謝產(chǎn)物相關(guān)的功能基因多樣性研究。結(jié)果表明,所采集的沼氣池污泥中含有較為豐富的產(chǎn)甲烷菌資源,但其中也可能存在類似功能或產(chǎn)生類似代謝物質(zhì)的產(chǎn)甲烷菌。 本論文的意義與主要?jiǎng)?chuàng)新點(diǎn)是：建立了農(nóng)村戶用沼氣池污泥微生物多樣性分析平臺,并初步分析了農(nóng)村戶用沼氣池微生物多樣性,不僅為進(jìn)一步優(yōu)化沼氣發(fā)酵微生物群落結(jié)構(gòu)、篩選功能基因提供了科學(xué)依據(jù),而且為實(shí)現(xiàn)高效、可控的農(nóng)村沼氣發(fā)酵工藝奠定了基礎(chǔ)。
【學(xué)位單位】：湖南師范大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2011
【中圖分類】：S216.4;S182
【部分圖文】：

酶復(fù)合形成的。另外，產(chǎn)甲烷菌可以吸收環(huán)境中的硫酸根(5042一)，通過一系列的酶代謝途徑最終形成硫化氫[’‘]。迄今為止，發(fā)現(xiàn)了3種甲烷生物合成途徑，如圖1一1。第1種甲烷生物合成途徑的原料是乙酸[1“]，占自然界中甲烷合成的60%以上;第2種甲烷生物合成途徑的原料是氫、二氧化碳，占自然界中甲烷合成的30%;第3種甲烷生物合成途徑的原料甲基化合物，如甲醇、甲酸、甲基胺、甲基硫等。3種途徑最終均形成甲基輔酶M[l3]，然

菌為同源性較高的一類菌群，提出了一種較為完整的分類系統(tǒng)。依據(jù)13種17個(gè)菌株的分析，這一系統(tǒng)中產(chǎn)甲烷菌分為3目、4科、7屬、13種。根據(jù) 165rRNA基因序列而構(gòu)建的古菌系統(tǒng)發(fā)育樹見圖1一2158]，從發(fā)育樹中可以看出，整個(gè)古菌域中產(chǎn)甲烷菌具有最多的種屬，占有重要的分類學(xué)地位。Keyser等應(yīng)用DGGE技術(shù)對存在于三種UASB生物反應(yīng)器污泥顆粒中產(chǎn)甲烷古菌進(jìn)行了鑒定，根據(jù)所得數(shù)據(jù)建立了能快速鑒定UAsB顆粒微生物中古菌群的DGGE標(biāo)記物[5”]。、認(rèn)nagita[60]等應(yīng)用FlsH技術(shù)對綿羊瘤胃中的產(chǎn)甲烷古菌進(jìn)化樹進(jìn)行分析與鑒定。

同一份污泥樣品的3份平行樣品，用化學(xué)裂解法、溶菌酶裂解法和Kit法提取DNA，在 4.SV/cm、 15OC、脈沖時(shí)間15到 125條件下電泳 1sh，進(jìn)行1.0%的脈沖場凝膠電泳和染色(圖2一2)。結(jié)果表明:化學(xué)裂解法、溶菌酶裂解法得到的DNA量大，片段大小集中在48.5kb左右，最大片段可達(dá)到97.Okb。Kit法得到的DNA量小，片段大小集中在 23.1kb左右，最大片段小于48.5kb。這進(jìn)一步說明Kit法提取的DNA得率低
【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：2843858