【摘要】： 隨著人類社會的發(fā)展，能源短缺、環(huán)境污染問題日益突出，已嚴重威脅人類的生存和發(fā)展。沼氣技術是解決我國農村能源危機和環(huán)境污染，實現農業(yè)可持續(xù)發(fā)展的有效途徑。由于傳統(tǒng)研究手段的限制，目前對沼氣發(fā)酵微生物群落結構缺乏全面、準確的了解，從而阻礙了工程和工藝的改進進程，致使農村系統(tǒng)運行效率低和可控性差的問題難以解決。現代分子生態(tài)學技術在環(huán)境微生物研究中的成功應用，為突破這一技術瓶頸提供了新思路。本論文運用基于16S rDNA的克隆文庫分析和DGGE指紋圖譜分析等分子生態(tài)學技術，對農村戶用沼氣池發(fā)酵微生物的群落結構進行了解析。 首先通過對前人活性污泥的提取方法改進，建立了農村戶用沼氣池厭氧活性污泥總DNA的有效提取和純化方法，DNA的得率、完整性、質量均可滿足分子生態(tài)學研究的需要。 通過對PCR-DGGE條件的優(yōu)化，建立了農村戶用沼氣池厭氧活性污泥微生物16S rDNA V3區(qū)PCR-DGGE分析體系：25μ1 PCR反應體系中，模板量為1ng；采用Touchdown PCR方式；DGGE膠變性劑濃度范圍35％～56％；上樣量為600ng，150V電泳270min，可較為準確地反映農村戶用沼氣池厭氧活性污泥微生物的多樣性和群落組成。 分別構建了農村戶用沼氣池細菌和古菌的16S rDNA文庫，通過文庫分析，對農村戶用沼氣池發(fā)酵微生物的多樣性進行了探索。結果表明，農村戶用沼氣池發(fā)酵系統(tǒng)微生物種類非常豐富，細菌比古菌表現出更為復雜的微生物多樣性。不同微生物種群的豐度存在明顯差異，有少數明顯優(yōu)勢種群。其中的細菌，包括72個種群，大多數屬于未培養(yǎng)菌，主要分屬于五大類：低G+C革蘭氏陽性菌(Firmicutes)、變形細菌(Protecobacteria)、擬桿菌(Bacteroidetes)、綠屈撓菌(Chloroflexi)和Genera-incertae-sedis-OP11。其中以低G+C革蘭氏陽性菌為主，包含其2個亞類：梭菌(Clostridia)和芽孢桿菌(Bacilli)，占庫容的54％，其次為擬桿菌占庫容36％；其中的古菌，包括9個種群，都屬于廣古菌(Euryarchaeota)，包括甲烷鬃菌(Methanosaeta)、小甲烷粒菌(Methanocorpusculum)、甲烷八疊球菌(Methanosarcina)和甲烷盤菌(Methanoplanus)、甲烷囊菌(Methanoculleus)等，一分類地位不明確的Uncultured euryarchaeote和Methanocorpusculum parvum為優(yōu)勢種群。 利用PCR-DGGE指紋圖譜分析技術對農村戶用沼氣池中正常池和酸化池的細菌和古菌微生物群落結構分別進行了比較，并進行動態(tài)跟蹤監(jiān)測。結果顯示：兩種沼氣池中微生物種類都非常豐富，細菌比古菌表現出更為復雜的微生物多樣性。不同微生物種群的豐度存在明顯差異，有少數明顯優(yōu)勢種群，這與16S rDNA克隆文庫分析結論基本一致。正常池與酸化池的細菌群落結構存在明顯差異，酸化池中梭菌(Clostridia)比重高，而擬桿菌(Bacteroidetes)相對較少；而兩種池中古菌的群落結構非常相似。由此初步推斷，影響農村戶用沼氣池發(fā)酵狀況的可能主要是細菌，而不是古菌；不同時期，正常池和酸化池中細菌和古菌的多樣性都基本穩(wěn)定，但部分種群的豐度隨著溫度的變化有所改變，擬桿菌(Bacteroidetes)豐度的隨發(fā)酵溫度升高增加，而梭菌(Clostridial則相反。 本論文初步解析了農村戶用沼氣池發(fā)酵微生物的群落結構，為進一步優(yōu)化群落結構、調節(jié)群落功能提供了科學依據，為實現我國農村沼氣發(fā)酵的高效、可控運行奠定了基礎。
【學位授予單位】：華中師范大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2007
【分類號】：S216.4;S182
【圖文】：

圖1一2穩(wěn)定性同位素探測技術的技術路線示意圖sIP技術可以應用于厭氧環(huán)境中互營微生物的研究。o印han等(2001)通過該技在冰冷的缺氧沉積物中檢測到極低的’3c:甲烷自然豐度(同其它含碳化合物相)，這表明這些沉積物中存在一組與Methanosarcinales相關的可氧化甲烷的古菌，

2.1實驗材料2.1.1厭氧活性污泥樣品來源活性污泥樣品采集于北京郊區(qū)某能源生態(tài)技術示范基地(圖2一1)沼氣池，基地采用的是以沼氣為紐帶，目前在中國農村大力推廣的“豬一沼一果”生態(tài)家園模式。沼氣池建在果樹塑料大棚中豬圈的下面，沼氣發(fā)酵原料為豬糞。采集厭氧活性污泥樣品4℃厭氧保存，12小時內對樣品進行處理。圖2一1北京郊區(qū)某能源生態(tài)技術示范基地2.1.2菌株菌株 EscherichiacoliDH5a為中國農業(yè)科學院生物技術所保存。2.1.3培養(yǎng)基液體 LBTryptone10.09， Yeastextract5.09， NaCI10.09，定容至IL

本論文的厭氧污泥樣品采集于北京郊區(qū)某能源生態(tài)技術示范基地沼氣池。基地在開展本研究之前已運行兩年，基地采用的是目前在我國農村大力推廣的“豬一沼一果”生態(tài)模式(圖3一l)。沼氣池建于果樹塑料大棚中豬圈的下面，豬糞作為沼氣發(fā)酵的原料，經厭氧發(fā)酵產生沼氣、二氧化碳和沼肥。沼氣發(fā)酵使農村重要污染源一畜禽糞便得以充分利用，所產生的沼氣還可以用作生活燃料，二氧化碳可促進果樹的光合作用，同時沼肥是優(yōu)質的有機肥。沼氣池是該模式的核心，它聯(lián)結著養(yǎng)殖和種植，起到了生產和生活的樞紐作用。2006年初，本研究對該村80多戶農村戶用沼氣池的運行狀況(發(fā)酵液的酸堿度和產氣量狀況等)進行了初步調查分析。調查結果(表3一l)顯示:發(fā)酵液pH為7.0一7.5、發(fā)酵狀況正常、產氣量較高的沼氣池占42%;pH低于6.7、產氣量低的酸化池占58%。比較發(fā)現，發(fā)酵狀況正常的沼氣池液面泡沫較碎、厚、而小(圖3一2)

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本文編號：2803431