【摘要】： 微生物油質(zhì)資源的開(kāi)發(fā)利用是解決能源危機(jī)的重要新途徑之一。但微生物生產(chǎn)油脂成分復(fù)雜,難以滿足生物柴油對(duì)長(zhǎng)鏈單不飽和脂肪酸的要求。植物中的△9硬脂酰-ACP脫飽和酶(Stearoyl-ACP desaturase,SAD)催化在第9-10碳原子之間脫氫形成脂肪酸的第一個(gè)雙鍵,直接決定植物儲(chǔ)脂中不飽和脂肪酸的比例。近年來(lái)隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展,利用外源基因調(diào)控生物代謝的研究受到關(guān)注,這無(wú)疑為產(chǎn)油菌種改良,指明了一個(gè)新的途徑。本實(shí)驗(yàn)室克隆到了優(yōu)良油料樹(shù)種千年桐的SAD基因,并構(gòu)建了該基因的真菌表達(dá)載體pCAM2300-sad,期望通過(guò)將其導(dǎo)入產(chǎn)油真菌,調(diào)控其油脂代謝途徑來(lái)提高產(chǎn)油菌油脂品質(zhì)。 本實(shí)驗(yàn)利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法,對(duì)產(chǎn)油酵母淺白隱球酵母進(jìn)行了遺傳轉(zhuǎn)化,并對(duì)農(nóng)桿菌菌株,農(nóng)桿菌及酵母農(nóng)濃度,共培養(yǎng)時(shí)間,共培養(yǎng)期AS濃度等影響轉(zhuǎn)化效率的關(guān)鍵因子進(jìn)行了優(yōu)化。結(jié)果表明:利用農(nóng)桿菌菌株AGL-1介導(dǎo),農(nóng)桿菌濃度為1×109個(gè)細(xì)胞/mL,酵母濃度為5×106至1×107個(gè)細(xì)胞/mL,在含有AS 200μmol/L條件下共培養(yǎng)48 h可獲得較高的轉(zhuǎn)化率。PCR及RT-PCR檢測(cè)表明,SAD基因已成功轉(zhuǎn)入淺白隱球酵母中,并能在淺白隱球酵母受體中轉(zhuǎn)錄成mRNA。對(duì)轉(zhuǎn)基因菌株進(jìn)行搖瓶發(fā)酵,測(cè)定生物量及油脂含量,得到油脂產(chǎn)量高于對(duì)照的菌株一株,編號(hào)E-2,其油脂產(chǎn)量為1.74 g/L,油脂含量為16.19g/L,分別提高了14.47%和9.39%。對(duì)9個(gè)轉(zhuǎn)化子油脂脂肪酸組成進(jìn)行氣相色譜分析,油酸含量差距顯著,其中有3株油酸比例高于對(duì)照,2株低于對(duì)照,4株變化不明顯。其中X-1油酸比例最高,比對(duì)照提高了14.4%,同時(shí)棕櫚酸比例下降了18.75%。 同時(shí)本實(shí)驗(yàn)中對(duì)載體pCAM2300-sad進(jìn)行改造,構(gòu)建了含Zeocin篩選標(biāo)記基因的載體pCAM2300-sadz,并用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法對(duì)優(yōu)良產(chǎn)油酵母斯達(dá)氏油脂酵母進(jìn)行了遺傳轉(zhuǎn)化,初步獲得了一些轉(zhuǎn)化子。 本文通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)法實(shí)現(xiàn)了SAD基因?qū)\白隱球酵母和膠粘紅酵母中的遺傳轉(zhuǎn)化,并獲得了轉(zhuǎn)化菌株;通過(guò)氣相色譜對(duì)淺白隱球酵母轉(zhuǎn)化子油脂成分分析,最終篩選到了產(chǎn)油性能優(yōu)良的轉(zhuǎn)基因菌株;對(duì)農(nóng)桿菌介導(dǎo)淺白隱球酵母的轉(zhuǎn)化條件進(jìn)行了優(yōu)化,初步建立了農(nóng)桿菌介導(dǎo)的產(chǎn)油真菌遺傳轉(zhuǎn)化體系,為進(jìn)一步研究打下了基礎(chǔ)。
【圖文】：

圖 3-6 載體 pCAM2033-sadz 轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌 AGL-1-6 Transformation of pCAM2300-sadz to Agrobacterium圖 3-7 表達(dá)載體轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌 PCR 及酶切鑒定.3-7 PCR and Digestion identification of expression vect(a) M. DNA 分子量標(biāo)準(zhǔn)；1-4.農(nóng)桿菌質(zhì)粒 PCR 產(chǎn)物M 1 bp2000→1000→100 →2 3 4

.3.4 農(nóng)桿菌 Ti 質(zhì)粒轉(zhuǎn)化膠粘紅酵母共培養(yǎng)后，用 10 mL 無(wú)菌水將微孔濾膜上的菌體沖洗下來(lái)，吸取 50 μL 涂布于 SM養(yǎng)基上，培養(yǎng) 3-5d 能清晰的看到轉(zhuǎn)化子菌落（如圖 3-8）。挑取長(zhǎng)勢(shì)較好的菌落于 YPD體培養(yǎng)基中振蕩培養(yǎng) 24 h，玻璃珠法提取 DNA，SAD 基因 PCR 檢測(cè)結(jié)果如 3-9，部分化子在陽(yáng)性對(duì)照相同的位置有清晰條帶，，說(shuō)明表達(dá)載體已經(jīng)轉(zhuǎn)入這些菌株中。圖 3-7 表達(dá)載體轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌 PCR 及酶切鑒定Fig.3-7 PCR and Digestion identification of expression vector(a) M. DNA 分子量標(biāo)準(zhǔn)；1-4.農(nóng)桿菌質(zhì)粒 PCR 產(chǎn)物(b) M. DNA 分子量標(biāo)準(zhǔn)； 1-4. AGL-1 質(zhì)粒酶切產(chǎn)物(a) M. DNA Marker; 1-4. PCR products of Agrobacterium vector(b) M. DNA Marker; 1-4.Digestion identification of Agrobacterium vector
【學(xué)位授予單位】：中國(guó)林業(yè)科學(xué)研究院
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2010
【分類號(hào)】：S216.3;Q789

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本文編號(hào)：2659531