【目的】為研究萊茵衣藻(Chlamydomonasreinhardtii)泛素結(jié)合酶(ubiquitin-conjugatingenzymes,E2) CrUBC23在萊茵衣藻油脂代謝中的作用,為高產(chǎn)油微藻基因工程改良和揭示藻類油脂合成及代謝調(diào)控機(jī)理奠定基礎(chǔ)。【方法】qRT-PCR分析萊茵衣藻在低氮、低磷脅迫下泛素結(jié)合酶CrUBC23表達(dá)情況;克隆CrUBC23同源基因干涉片段和全長基因,構(gòu)建RNAi干涉載體和過量表達(dá)載體,轉(zhuǎn)化萊茵衣藻并檢測生物量和油脂含量;構(gòu)建CrUBC23-GFP融合表達(dá)載體,用農(nóng)桿菌浸染洋蔥表皮細(xì)胞進(jìn)行亞細(xì)胞定位。【結(jié)果】萊茵衣藻在低氮、低磷脅迫下CrUBC23基因表達(dá)量顯著增加,增加幅度分別為正常培養(yǎng)的4.98–5.80倍和1.85–5.20倍。RNAi干擾結(jié)果顯示,轉(zhuǎn)基因藻細(xì)胞中性脂含量降低5.5%,總脂含量降低3.16%–17.6%。過量表達(dá)結(jié)果顯示,轉(zhuǎn)基因藻細(xì)胞中性脂含量增加8.8%,總脂含量增加4.51%–14.03%�！窘Y(jié)論】CrUBC23正向調(diào)控萊茵衣藻油脂代謝,該基因定位于細(xì)胞核。

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【部分圖文】：

圖1.萊茵衣藻CC425缺氮(A)、缺磷(B)培養(yǎng)下CrUBC23mRNA水平

qRT-PCR結(jié)果顯示，萊茵衣藻CC425在正常培養(yǎng)、缺氮培養(yǎng)(HSM-N)、缺磷培養(yǎng)(HSM-P)下，隨著培養(yǎng)時(shí)間的增長CrUBC23mRNA水平顯著升高。在缺氮培養(yǎng)下CrUBC23mRNA水平顯著增加，第3天達(dá)到最大值，之后緩慢下降，CrUBC23mRNA水平是對(duì)照(CC....

圖2.CrUBC23與其他物種同源性比較

通過PCR擴(kuò)增獲得CrUBC23干涉片段(圖3-B-a)，插入pMD18-T，分別用HindⅢ/BamHⅠ和XbaⅠ/SalⅠ雙酶切獲得正反向干涉片段(圖3-B-b)，依次插入T282載體，獲得中間載體，EcoRⅠ酶切中間載體獲得含有CrUBC23正反向結(jié)構(gòu)的片段，插入pM....

圖3.CrUBC23轉(zhuǎn)基因藻株構(gòu)建

圖2.CrUBC23與其他物種同源性比較2.4CrUBC23RNAi轉(zhuǎn)基因藻株生物量及油脂含量測定

圖4.CrUBC23RNAi轉(zhuǎn)基因藻株分析

尼羅紅染色法測定了96株CrUBC23RNAi轉(zhuǎn)基因藻株和54株pMaa7IR/XIR轉(zhuǎn)基因藻株中性脂含量，CrUBC23RNAi轉(zhuǎn)基因藻株平均NFFluorescence/DW值為894，對(duì)照pMaa7IR/XIR平均NFFluorescence/DW值為1390(圖4....

本文編號(hào)：3987373