CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)是通過人工設(shè)計(jì)的單向?qū)NA(Single-guide RNA,sgRNA)指導(dǎo)Cas9蛋白對目的基因靶位點(diǎn)進(jìn)行特異性的識別、結(jié)合和切割后,通過細(xì)胞的非同源末端連接或同源末端重組修復(fù)機(jī)制來完成對基因組的敲除與敲入的編輯技術(shù)。RIG-I是機(jī)體的一種模式識別受體,能夠識別胞質(zhì)中的含5′-三磷酸基團(tuán)的RNA,并通過與下游信號分子MAVS相互作用,激活I(lǐng)RF3/7和NF-κB,從而啟動I型干擾素和炎性因子的表達(dá)。已有研究表明,B型流感病毒(IBV)在感染早期能夠上調(diào)RIG-I的表達(dá)水平。為了探索RIG-I是否為B型流感病毒激活抗病毒天然免疫信號通路的主要受體及其對IBV復(fù)制的影響,本研究利用CRISPR-Cas9技術(shù)對293T細(xì)胞中的RIG-I基因進(jìn)行了敲除,經(jīng)嘌呤霉素壓力篩選到了一株穩(wěn)定敲除RIG-I基因的293T(RIG-I-/-293T)細(xì)胞系。Western blotting檢測發(fā)現(xiàn),IBV或仙臺病毒感染后該細(xì)胞系中RIG-I不再表達(dá),說明該敲除細(xì)胞系構(gòu)建成功。IBV感染RIG-I-/-293T細(xì)胞后,干擾素、炎性因子及干擾素刺激基因的轉(zhuǎn)錄水平與野生型...

【文章頁數(shù)】：13 頁

【文章目錄】：
1 材料與方法
    1.1 材料
        1.1.1 細(xì)胞株和質(zhì)粒
        1.1.2 實(shí)驗(yàn)試劑
        1.1.3 引物合成及PCR檢測產(chǎn)物的測序
    1.2 實(shí)驗(yàn)方法
        1.2.1 sgRNA的設(shè)計(jì)與寡核苷酸鏈的合成
        1.2.2 重組Hu-RIG-I-sgRNA-pCS-1載體構(gòu)建
        1.2.3 重組pUCA(Luc)-target載體的構(gòu)建
        1.2.4 Hu-RIG-I-sgRNA-pCS-1的活性檢測
        1.2.5 293T細(xì)胞的嘌呤霉素藥物致死濃度篩選
        1.2.6 高活性Hu-RIG-I-sg RNA-p CS-1質(zhì)粒的細(xì)胞轉(zhuǎn)染
        1.2.7 藥物篩選及單克隆培養(yǎng)
        1.2.8 PCR鑒定陽性克隆
        1.2.9 Western blotting鑒定陽性克隆
        1.2.1 0 RIG-I對IBV誘導(dǎo)的干擾素、炎性因子及干擾素刺激基因的影響
        1.2.1 1 RIG-I對IBV感染后p65、磷酸化P65、IRF3及磷酸化IRF3表達(dá)的影響
        1.2.1 2 RIG-I對IBV生長曲線的影響
2 結(jié)果與分析
    2.1 重組載體Hu-RIG-I-sgRNA-pCS-1的構(gòu)建
    2.2 Hu-RIG-I-sgRNA-pCS-1向?qū)Ъ扒懈罨钚缘臋z測
    2.3 重組載體Hu-RIG-I-sgRNA2-pCS-1可高效切割靶位點(diǎn)造成RIG-I基因部分缺失
    2.4 IBV及SeV感染RIG-I-/-293T細(xì)胞后RIG-I蛋白表達(dá)缺失
    2.5 RIG-I可上調(diào)IBV誘導(dǎo)的干擾素、炎性因子及其干擾素刺激基因的轉(zhuǎn)錄
    2.6 RIG-I是IBV激活抗病毒天然免疫信號通路的主要受體之一
    2.7 RIG-I抑制IBV在293T細(xì)胞中的復(fù)制
3 討論



本文編號：3847993