近年來(lái),長(zhǎng)鏈多不飽和脂肪酸(LC-PUFA)對(duì)于人類(lèi)健康的重要性越來(lái)越受到重視。目前人類(lèi)獲取LC-PUFA的主要來(lái)源是深海魚(yú)油,然而魚(yú)油面臨資源短缺和環(huán)境污染的風(fēng)險(xiǎn),因此需要尋找新的替代來(lái)源。海洋微藻能從頭合成LC-PUFA,是海洋LC-PUFA的初級(jí)生產(chǎn)者。海洋微藻LC-PUFA合成代謝途徑的研究對(duì)于開(kāi)發(fā)LC-PUFA的替代來(lái)源具有重要的意義。長(zhǎng)鏈�；o酶A合成酶(LACS)在脂肪酸代謝中起關(guān)鍵作用。游離脂肪酸必須在LACS催化作用下活化成�；o酶A,才能進(jìn)入后續(xù)脂肪酸的代謝途徑,如碳鏈延長(zhǎng)、甘油三酯合成、糖脂合成、磷脂合成、β氧化等。研究LACS在產(chǎn)油微藻脂肪酸代謝中的功能有助于全面解析LC-PUFA的合成途徑。本論文以富含LC-PUFA的海洋微藻-三角褐指藻為對(duì)象,采用分子生物學(xué)和生化等方法研究五個(gè)長(zhǎng)鏈�；o酶A合成酶(ptACSL1-5)的生化特性。主要研究結(jié)果如下:(1)采用逆轉(zhuǎn)錄PCR擴(kuò)增ptACSL1-4編碼基因,分別構(gòu)建ptACSL1-4與GFP的融合表達(dá)質(zhì)粒,轉(zhuǎn)化三角褐指藻,通過(guò)觀察GFP熒光確定其亞細(xì)胞定位。結(jié)果表明:ptACSL1、ptACSL2和ptACSL3定...

【文章頁(yè)數(shù)】：76 頁(yè)

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
abstract
主要符號(hào)對(duì)照表
第一章 文獻(xiàn)綜述
    1.1 微生物來(lái)源的長(zhǎng)鏈多不飽和脂肪酸
        1.1.1 長(zhǎng)鏈多不飽和脂肪酸的營(yíng)養(yǎng)功效
        1.1.2 微生物長(zhǎng)鏈多不飽和脂肪酸的基本合成途徑
    1.2 產(chǎn)油硅藻油脂代謝研究進(jìn)展
        1.2.1 產(chǎn)油硅藻簡(jiǎn)介
        1.2.2 產(chǎn)油硅藻脂肪酸從頭合成途徑
        1.2.3 產(chǎn)油硅藻甘油三酯合成途徑
        1.2.4 產(chǎn)油硅藻甘油糖脂合成途徑
        1.2.5 產(chǎn)油硅藻脂肪�；诓煌�(lèi)中的流向
    1.3 長(zhǎng)鏈�；鵆oA合成酶
        1.3.1 長(zhǎng)鏈�；鵆oA合成酶簡(jiǎn)介
        1.3.2 大腸桿菌和釀酒酵母的酰基CoA合成酶的研究進(jìn)展
        1.3.3 植物長(zhǎng)鏈�；鵆oA合成酶的研究進(jìn)展
        1.3.4 產(chǎn)油微藻的長(zhǎng)鏈�；鵆oA合成酶的研究進(jìn)展
    1.4 硅藻基因組編輯研究進(jìn)展
        1.4.1 基因組編輯技術(shù)簡(jiǎn)介
        1.4.2 CRISPR/Cas9 技術(shù)簡(jiǎn)介
        1.4.3 硅藻基因組編輯研究進(jìn)展
    1.5 本研究的目的和內(nèi)容
第二章 ptACSL蛋白亞細(xì)胞定位
    2.1 引言
    2.2 實(shí)驗(yàn)材料與儀器
        2.2.1 菌株與培養(yǎng)條件
        2.2.2 實(shí)驗(yàn)試劑
        2.2.3 實(shí)驗(yàn)儀器
        2.2.4 培養(yǎng)基與溶液
        2.2.5 引物與質(zhì)粒
    2.3 實(shí)驗(yàn)方法
        2.3.1 三角褐指藻ptACSL1-4 基因的克隆
        2.3.2 蛋白定位預(yù)測(cè)
        2.3.3 蛋白跨膜預(yù)測(cè)
        2.3.4 GFP融合表達(dá)載體的構(gòu)建
        2.3.5 ptACSL1的GFP自組裝載體構(gòu)建
        2.3.6 三角褐指藻基因槍轉(zhuǎn)化
        2.3.7 三角褐指藻的GFP載體轉(zhuǎn)化子的篩選和檢測(cè)
        2.3.8 三角褐指藻共聚焦熒光觀察
    2.4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與討論
        2.4.1 ptACSL1-4的GFP融合載體以及ptACSL1GFP自組裝載體的構(gòu)建
        2.4.2 ptACSL1-5 蛋白的亞細(xì)胞定位
    2.5 小結(jié)
第三章 ptACSL的異源表達(dá)和底物特異性分析
    3.1 引言
    3.2 實(shí)驗(yàn)材料與儀器
        3.2.1 菌株與培養(yǎng)條件
        3.2.2 實(shí)驗(yàn)試劑
        3.2.3 實(shí)驗(yàn)儀器
        3.2.4 培養(yǎng)基與溶液
        3.2.5 引物與質(zhì)粒
    3.3 實(shí)驗(yàn)方法
        3.3.1 ptACSL大腸桿菌表達(dá)載體的構(gòu)建
        3.3.2 大腸桿菌異源表達(dá)ptACSL蛋白
        3.3.3 ptACSL蛋白純化
        3.3.4 ptACSL蛋白酶活測(cè)定
    3.4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果和討論
        3.4.1 大腸桿菌異源表達(dá)ptACSL蛋白
        3.4.2 ptACSL蛋白的酶活測(cè)定
    3.5 小結(jié)
第四章 ptACSL蛋白表達(dá)模式分析
    4.1 引言
    4.2 實(shí)驗(yàn)材料與儀器
        4.2.1 菌株與培養(yǎng)條件
        4.2.2 實(shí)驗(yàn)試劑
        4.2.3 實(shí)驗(yàn)儀器
        4.2.4 培養(yǎng)基與溶液
    4.3 實(shí)驗(yàn)方法
        4.3.1 三角褐指藻的缺氮培養(yǎng)
        4.3.2 三角褐指藻的不同CO2濃度培養(yǎng)
        4.3.3 ptACSL蛋白的Western blot檢測(cè)
    4.4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果和討論
        4.4.1 缺氮條件下ptACSL蛋白的表達(dá)模式
        4.4.2 不同CO₂濃度培養(yǎng)下ptACSL蛋白的表達(dá)模式
    4.5 小結(jié)
第五章 ptACSL基因敲除
    5.1 引言
    5.2 實(shí)驗(yàn)材料與儀器
        5.2.1 菌株與培養(yǎng)條件
        5.2.2 實(shí)驗(yàn)試劑
        5.2.3 實(shí)驗(yàn)儀器
        5.2.4 培養(yǎng)基與溶液
        5.2.5 引物和質(zhì)粒
    5.3 實(shí)驗(yàn)方法
        5.3.1 ptACSL基因的sgRNA設(shè)計(jì)
        5.3.2 sgRNA表達(dá)盒的構(gòu)建
        5.3.4 基因敲除株的篩選
        5.3.5 基因敲除株的驗(yàn)證
    5.4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與討論
        5.4.1 ptACSL基因的sgRNA設(shè)計(jì)
        5.4.2 ptACSL基因敲除突變株的篩選
        5.4.3 ptACSL基因敲除突變株的驗(yàn)證
    5.5 小結(jié)
第六章 討論
參考文獻(xiàn)
致謝
作者簡(jiǎn)介



本文編號(hào)：3787265