石油烴化合物的污染治理是亟待解決的問題,微生物修復是一種理想的方法,而目前烴類污染物的成分復雜及疏水特性限制了降解菌對其攝取和降解。本研究以銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa)DN1作為出發(fā)菌株,對其參與石油烴化合物降解及趨化性過程中的關鍵基因展開功能探索,以期揭示微生物如何攝取利用烴類污染物的分子轉運機制,進而實現(xiàn)烴類污染物修復。前期的研究表明,銅綠假單胞菌DN1具有降解原油、烷烴和芳烴的能力。為進一步了解其降解機制,首先利用比較基因組學手段預測分析了6株石油烴降解菌株中烷烴羥化酶、環(huán)羥基化雙加氧酶及趨化系統(tǒng),比對結果顯示:石油烴降解菌的降解酶系統(tǒng)呈現(xiàn)多樣性,但這些基因的同源性及分布之間存在一定差異,在一定程度上影響并決定了菌株底物降解譜的多樣性。其次,我們通過氣相色譜技術檢測了菌株DN1對原油和不同正構烷烴的降解情況,同時利用RT-qPCR技術監(jiān)測了烷烴羥化酶基因的實時表達,并通過同源重組技術構建基因缺失突變株進一步研究其基因功能。實驗結果表明:DN1能夠利用原油和鏈長為8-40個碳原子的多種正構烷烴作為唯一碳源,降解率高達85%。RT-qPCR分析顯示,五...

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【學位級別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
ABSTRACT
縮略語對照表
第一章 緒論
    1.1 石油烴污染物及其治理
        1.1.1 石油烴的危害及組分
        1.1.2 石油烴污染物的治理技術
    1.2 石油烴污染物微生物降解概述
        1.2.1 石油烴降解微生物
        1.2.2 石油烴降解酶
        1.2.3 提高石油烴污染物降解的措施
    1.3 趨化性在石油烴污染物降解過程中的作用
        1.3.1 細菌趨化性概述
        1.3.2 甲基受體趨化蛋白在趨化過程中的作用
    1.4 本文研究內容及意義
第二章 實驗材料與方法
    2.1 實驗材料
        2.1.1 實驗所用菌株、質粒及引物
        2.1.2 實驗所用試劑
        2.1.3 實驗所用儀器
        2.1.4 培養(yǎng)基及抗生素的配制
    2.2 基礎實驗方法
        2.2.1 感受態(tài)細胞的制備
        2.2.2 質粒DNA的小量提取
        2.2.3 目的片段的PCR及純化回收
        2.2.4 酶切和連接
        2.2.5 化學轉化
        2.2.6 突變株的構建
        2.2.7 RNA的提取、純化及濃度測定
        2.2.8 RNA反轉錄
        2.2.9 實時熒光定量PCR
        2.2.10 聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)
    2.3 烷烴降解酶基因功能初探
        2.3.1 DN1對原油的降解
        2.3.2 DN1對不同正構烷烴生物降解性能分析實驗
        2.3.3 原油中烷烴降解譜的測定
        2.3.4 烷烴含量的測定
        2.3.5 烷烴降解相關基因的預測
        2.3.6 RT-qPCR分析烷烴降解酶基因的實時表達
        2.3.7 烷烴羥化酶突變株的構建
        2.3.8 DN1和突變株對烷烴的生物降解
    2.4 趨化性在烴類污染物降解過程的作用探索
        2.4.1 銅綠假單胞菌趨化系統(tǒng)的比較分析
        2.4.2 甲基受體趨化蛋白(MCP)的結構預測及分析
        2.4.3 MCP基因缺失突變株的構建
        2.4.4 滴定法(Drop assay)
        2.4.5 游動平板法(Swarm plate assay)
        2.4.6 甲基受體趨化蛋白的體外表達及純化
        2.4.7 等溫滴定熱量法(Isothermal Titration Calorimetry,ITC)實驗
第三章 結果與討論
    3.1 銅綠假單胞菌DN1參與烴類污染物降解的比較基因組學分析
        3.1.1 銅綠假單胞菌屬烷烴單加氧酶alk B基因簇分析
        3.1.2 銅綠假單胞菌屬環(huán)羥基化雙加氧酶比較分析
        3.1.3 銅綠假單胞菌屬趨化系統(tǒng)分析
    3.2 DN1對烷烴的降解及烷烴羥化酶基因功能分析
        3.2.1 菌株DN1對原油的降解
        3.2.2 菌株DN1對不同正構烷烴的生物降解
        3.2.3 DN1中烷烴羥化酶編碼基因分析
        3.2.4 不同烷烴誘導下alk₁,alkB₂,p450,almA₁和almA₂的實時表達
        3.2.5 烷烴羥化酶系統(tǒng)在烷烴降解中的作用
    3.3 菌株DN1及部分MCP突變株的趨化性研究
        3.3.1 菌株DN1的趨化性
        3.3.2 部分mcp突變株對烴類污染物的趨化性
        3.3.3 甲基受體趨化蛋白mcp04325基因外源表達
        3.3.4 ITC分析Mcp04325蛋白與原兒茶酸的結合能力
第四章 結論
參考文獻
致謝
攻讀碩士學位期間取得的科研成果



本文編號：3770197