目的利用CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)高效構(gòu)建Bpi基因敲除的小鼠模型,并繼續(xù)繁殖、鑒定及建立穩(wěn)定遺傳的Bpi基因敲除小鼠品系。方法針對(duì)C57BL/6小鼠Bpi基因的第2～3外顯子兩端設(shè)計(jì)敲除靶點(diǎn),篩選高活性gRNA（guide RNA）靶點(diǎn),體外轉(zhuǎn)錄得到sgRNA（small guide RNA）并與Cas9 mRNA一起顯微注射到C57BL/6小鼠的受精卵內(nèi),經(jīng)胚胎移植至代孕母鼠體內(nèi),獲得F0代小鼠后,通過基因型鑒定和DNA測(cè)序獲得基因突變的陽性子代鼠。結(jié)果篩選到高活性gRNA靶點(diǎn)并成功獲得體外轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物sgRNA;與Cas9 mRNA一起通過顯微注射的方式獲得了64枚狀態(tài)良好的受精卵并成功移植到2只代孕母鼠體內(nèi);獲得了22只F0代小鼠,經(jīng)PCR鑒定和DNA測(cè)序后選擇一只單鏈缺失708 bp堿基的陽性小鼠進(jìn)行擴(kuò)繁,并在F1、F2代檢測(cè)到該突變,且F2代成功繁育出純合子小鼠。結(jié)論成功構(gòu)建Bpi基因敲除小鼠模型,為進(jìn)一步研究Bpi基因及其表達(dá)產(chǎn)物的生物學(xué)功能奠定了基礎(chǔ)。 

【文章頁數(shù)】：8 頁

【文章目錄】：
1 材料和方法
    1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物
    1.2 主要試劑與儀器
    1.3 實(shí)驗(yàn)方法
        1.3.1 根據(jù)Bpi序列結(jié)構(gòu)，分析CRISPR/gRNA靶點(diǎn)設(shè)計(jì)位置
        1.3.2 sgRNA和Cas9 mRNA的體外轉(zhuǎn)錄與靶點(diǎn)活性檢測(cè)
        1.3.3 小鼠超數(shù)排卵、受精卵注射以及胚胎移植
        1.3.4 F0代小鼠的基因型鑒定和DNA測(cè)序
        1.3.5 F0代小鼠的飼養(yǎng)與擴(kuò)繁
2 結(jié)果
    2.1 CRISPR/gRNA靶點(diǎn)設(shè)計(jì)
    2.2 高活性Cas9/gRNA敲除靶點(diǎn)篩選
    2.3 F0代小鼠的鑒定及子代繁育
3 討論
    3.1 Bpi基因敲除小鼠遺傳穩(wěn)定品系的建立
    3.2 CRISPR/Cas9技術(shù)基因敲除小鼠的脫靶風(fēng)險(xiǎn)
    3.3 Bpi基因敲除小鼠的表型變化
    3.4 構(gòu)建Bpi基因敲除小鼠的意義
    3.5 Bpi———潛在的新型抗菌藥物


【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]基于CRISPR/Cas9技術(shù)構(gòu)建多重sgRNA實(shí)現(xiàn)在人原代T細(xì)胞中敲除ADRB2基因[J]. 孫毓,劉丹,施明,鄭駿年.  中國實(shí)驗(yàn)血液學(xué)雜志. 2019(05)
[2]CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)在腫瘤研究及治療中的應(yīng)用[J]. 王韶嶸,高興春,陳芳妮,喬文偉,米亞靜.  實(shí)用癌癥雜志. 2019(07)
[3]豬殺菌性/通透性增強(qiáng)蛋白（BPI）的功能及其在抗病育種中應(yīng)用的研究進(jìn)展[J]. 戴超輝,董文華,吳嘉韻,包文斌,吳圣龍.  中國畜牧獸醫(yī). 2016(10)
[4]BPI-BD3融合抗菌肽修飾C3H10T1/2細(xì)胞對(duì)小鼠感染創(chuàng)面愈合的影響[J]. 張欣然,劉翠,錢智勇,徐紅梅,郭希民,郭紅延.  解放軍醫(yī)學(xué)雜志. 2015(09)
[5]殺菌蛋白rBPI23與haFGF融合基因及真核表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建[J]. 彭海英,朱家勇.  臨床和實(shí)驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志. 2009(12)
[6]殺菌/滲透增強(qiáng)蛋白在小鼠組織器官和細(xì)胞中的分布[J]. 郭玲,許晴,呂喆,劉振龍,范宜強(qiáng),王煒,孔慶利,安云慶.  首都醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào). 2009(05)

碩士論文
[1]魚類來源的兩種抗菌肽BPI和LEAP2的cDNA克隆及重組表達(dá)載體的構(gòu)建[D]. 高北.上海海洋大學(xué) 2013
[2]牛殺菌—通透性增加蛋白和防御素基因融合質(zhì)粒的構(gòu)建及其在大腸桿菌中表達(dá)[D]. 胡伶俐.華中農(nóng)業(yè)大學(xué) 2010



本文編號(hào)：3677628