肽基脯氨酰順反異構(gòu)酶（Peptidyl Prolyl cis/trans Isomerase,PPIase）存在于各種生物體中,它的主要功能是通過催化多肽鏈中X-Pro肽鍵從順式向反式轉(zhuǎn)化,加速蛋白質(zhì)的折疊,是蛋白質(zhì)折疊的限速酶。植物的葉綠體中有很多PPIase,我們對(duì)它們的功能知之甚少。本研究主要用CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)和T-DNA突變體篩選方法創(chuàng)建擬南芥葉綠體部分PPIase的缺失突變體,然后對(duì)它們生長表型及其在光合作用中的生理功能進(jìn)行分析,增加對(duì)葉綠體PPIase和光合作用的認(rèn)識(shí)。擬南芥葉綠體基質(zhì)中共有3個(gè)PPIases蛋白,分別是CYP20-3、TIG和PIN3。本研究通過鑒定T-DNA插入突變體,得到了缺失突變體cyp20-3（SALK＿001615）、tig（SALK＿037730）和pin3（GK＿068C12）,然后通過雜交得到了cyp20-3×tig雙重突變體。在表型分析實(shí)驗(yàn)中,發(fā)現(xiàn)單基因突變體和cyp20-3×tig雙重突變體的表型與野生型相比在生長發(fā)育方面沒有明顯的差異,我們推測(cè)基質(zhì)PPIase蛋白可能與其它蛋白的功能存在冗余現(xiàn)象。利用BN-PAGE實(shí)... 

【文章頁數(shù)】：98 頁

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
ABSTRACT
第一章 緒論
    1.1 光合作用
        1.1.1 PSⅠ和 PSⅡ
        1.1.2 光合電子傳遞鏈
    1.2 PPIase
        1.2.1 擬南芥PPIase蛋白研究進(jìn)展
        1.2.2 擬南芥葉綠體PPIase蛋白研究進(jìn)展
    1.3 CRISPR/Cas9 基因編輯技術(shù)
        1.3.1 CRISPR/Cas9 組成與作用方式
        1.3.2 CRISPR/Cas9 的應(yīng)用
    1.4 本課題研究的意義
第二章 基質(zhì)PPIase突變體的獲得
    2.1 材料與試劑
        2.1.1 實(shí)驗(yàn)材料
        2.1.2 主要儀器與試劑
    2.2 實(shí)驗(yàn)方法
        2.2.1 突變體DNA水平鑒定方法
        2.2.2 突變體RNA水平鑒定方法
    2.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析
        2.3.1 CYP20-3 T-DNA插入突變體的鑒定結(jié)果與分析
        2.3.2 TIG T-DNA插入突變體的鑒定結(jié)果與分析
        2.3.3 PIN3 T-DNA插入突變體的鑒定結(jié)果與分析
        2.3.4 T-DNA插入突變體的RNA水平鑒定結(jié)果與分析
    2.4 本章小結(jié)
第三章 基質(zhì)PPIase缺失突變體的初步分析
    3.1 基質(zhì)PPIase突變體表型觀察
        3.1.1 材料與試劑
        3.1.2 實(shí)驗(yàn)方法及結(jié)果
    3.2 雙重突變體和三重突變體的獲得
        3.2.1 材料與試劑
        3.2.2 實(shí)驗(yàn)方法及結(jié)果
    3.3 基質(zhì)PPIase突變體BN-PAGE分析
        3.3.1 材料與試劑
        3.3.2 BN-PAGE實(shí)驗(yàn)原理與方法
        3.3.3 BN-PAGE實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析
    3.4 TIG互補(bǔ)植株獲得
        3.4.1 材料與試劑
        3.4.2 實(shí)驗(yàn)方法
        3.4.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析
    3.5 本章小結(jié)
第四章 類囊體腔PPIase突變體的獲得
    4.1 材料與試劑
        4.1.1 實(shí)驗(yàn)材料
        4.1.2 主要儀器與試劑
        4.1.3 網(wǎng)站信息
    4.2 FKBP16-4 T-DNA插入突變體鑒定方法
    4.3 CRISPR/Cas9 創(chuàng)建突變體方法
        4.3.1 設(shè)計(jì)gRNA spacer
        4.3.2 擴(kuò)增tRNA-gRNA小片段所需模板及引物
        4.3.3 擴(kuò)增tRNA-gRNA小片段
        4.3.4 片段純化
        4.3.5 酶切連接
        4.3.6 酶切連接驗(yàn)證
        4.3.7 PTG片段連接pMD18-T
        4.3.8 大腸桿菌轉(zhuǎn)化
        4.3.9 單克隆驗(yàn)證
        4.3.10 測(cè)序保種及提質(zhì)粒
        4.3.11 目的片段與pRGEB32載體連接及轉(zhuǎn)化
        4.3.12 農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化
        4.3.13 花浸染法侵染野生型擬南芥
        4.3.14 轉(zhuǎn)基因植株鑒定
    4.4 FKBP16-4 T-DNA插入突變體鑒定結(jié)果與分析
        4.4.1 FKBP16-4 T-DNA插入突變體DNA水平鑒定結(jié)果與分析
        4.4.2 FKBP16-4 T-DNA插入突變體RNA水平鑒定結(jié)果與分析
    4.5 CRISPR/Cas9 創(chuàng)建突變體鑒定結(jié)果與分析
        4.5.1 gRNA spacer的設(shè)計(jì)
        4.5.2 tRNA-gRNA引物設(shè)計(jì)及小片段合成
        4.5.3 小片段純化及酶切連接結(jié)果
        4.5.4 連接pMD18-T結(jié)果
        4.5.5 PTG連接pRGEB32 結(jié)果
        4.5.6 突變體篩選結(jié)果
    4.6 本章小結(jié)
第五章 類囊體腔部分PPIase缺失突變體的初步分析
    5.1 FKBP16-4初步探究
        5.1.1 材料與試劑
        5.1.2 實(shí)驗(yàn)方法
        5.1.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析
    5.2 FKBP13、FKBP17-1、FKBP18 初步探究
        5.2.1 材料與試劑
        5.2.2 實(shí)驗(yàn)方法與結(jié)果
    5.3 本章小結(jié)
結(jié)論
參考文獻(xiàn)
附表1
附表2
攻讀碩士學(xué)位期間取得的科研成果
致謝


【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]CRISPR基因編輯技術(shù)及其應(yīng)用與檢測(cè)方法[J]. 石偉佳,劉芳.  農(nóng)業(yè)與技術(shù). 2020(04)
[2]光系統(tǒng)Ⅰ（PSⅠ）的結(jié)構(gòu)與功能研究進(jìn)展[J]. 郁飛,唐崇欽,辛越勇,彭德川,許亦農(nóng),李良璧,匡廷云.  植物學(xué)通報(bào). 2001(03)



本文編號(hào)：3664985