黑曲霉被廣泛應(yīng)用于商用蛋白的生產(chǎn),但是針對黑曲霉的遺傳操作工具卻比較單一化。傳統(tǒng)的同源重組系統(tǒng)有著操作簡便、適用范圍廣的特點,但是其效率普遍偏低,因此一套操作簡便而且效率高的遺傳操作工具亟待開發(fā)。黑曲霉具有強大的胞外蛋白分泌能力,但是異源蛋白在黑曲霉中的分泌表達能力卻不盡人意。對其限制因素的分析表明,異源蛋白基因的轉(zhuǎn)錄以及m RNA穩(wěn)定性水平總體上是令人滿意的,其生產(chǎn)瓶頸主要存在于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中蛋白翻譯后分泌途徑中的修飾過程。磷脂作為內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的主要成分,對內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的形態(tài)、體積、功能有重要的影響。釀酒酵母中報道過主要調(diào)控磷脂代謝的轉(zhuǎn)錄因子ino2/ino4除了對磷脂代謝調(diào)控有主導(dǎo)作用,進而影響內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的功能,也會影響內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白加工穩(wěn)態(tài)環(huán)境。然而在黑曲霉中,關(guān)于磷脂代謝的轉(zhuǎn)錄調(diào)控研究得卻是少之又少。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)磷脂穩(wěn)態(tài)失衡會造成脂質(zhì)雙層成分的擾動,進而影響內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的形態(tài),這種變化可以獨立于UPR壓力而激活內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的UPR效應(yīng)。同時,蛋白分泌途徑中UPR信號機制除了作為內(nèi)質(zhì)網(wǎng)壓力的應(yīng)答途徑,促進控制胞內(nèi)蛋白質(zhì)量控制與動態(tài)平衡外,UPR調(diào)控基因中也包含許多與磷脂代謝相關(guān)的功能基因。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的蛋白穩(wěn)態(tài)與磷脂代謝穩(wěn)態(tài)有某... 

【文章頁數(shù)】：198 頁

【學(xué)位級別】：博士

【文章目錄】：
摘要
abstract
第一章 緒論
    1.1 黑曲霉基因編輯系統(tǒng)
        1.1.1 黑曲霉基因編輯系統(tǒng)發(fā)展概述
        1.1.2 絲狀真菌中CRISPR/Cas9 系統(tǒng)的應(yīng)用現(xiàn)狀
        1.1.3 黑曲霉中CRISPR系統(tǒng)目前所面臨的一些問題
    1.2 黑曲霉蛋白合成分泌與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)UPR機制的關(guān)系
        1.2.1 黑曲霉蛋白分泌途徑概述
        1.2.2 絲狀真菌內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的UPR效應(yīng)機制
        1.2.3 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)UPR機制在絲狀真菌蛋白生產(chǎn)中的應(yīng)用
    1.3 真菌內(nèi)質(zhì)網(wǎng)UPR效應(yīng)與膜結(jié)構(gòu)相互影響
        1.3.1 真菌內(nèi)質(zhì)網(wǎng)結(jié)構(gòu)概述
        1.3.2 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)脂質(zhì)的擾動可以激活內(nèi)質(zhì)網(wǎng)UPR效應(yīng)
        1.3.3 真菌磷脂相關(guān)代謝物的擾動可以激活UPR效應(yīng)
    1.4 真菌磷脂合成機制
        1.4.1 真菌磷脂合成途徑
        1.4.2 真菌磷脂合成的遺傳調(diào)控
        1.4.3 肌醇對于真核微生物磷脂合成的調(diào)控
        1.4.4 磷脂代謝調(diào)控與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)壓力誘導(dǎo)UPR效應(yīng)的關(guān)系
    1.5 本課題的研究意義以及主要內(nèi)容
        1.5.1 本課題的研究意義
        1.5.2 本課題的研究內(nèi)容
第二章 基于CRISPR-HDR技術(shù)的黑曲霉基因的大片段敲除以及多片段、多拷貝插入平臺的建立
    2.1 引言
    2.2 實驗材料與儀器
        2.2.1 主要儀器設(shè)備
        2.2.2 主要試劑/試劑盒
        2.2.3 質(zhì)粒載體
        2.2.4 菌種
        2.2.5 培養(yǎng)基配方
        2.2.6 引物序列
    2.3 實驗方法
        2.3.1 菌體的培養(yǎng)
        2.3.2 黑曲霉CRISPR敲除fwn A基因的sg RNA表達質(zhì)粒的構(gòu)建
        2.3.3 黑曲霉體外轉(zhuǎn)錄合成sgRNA
        2.3.4 包含Cas9 蛋白表達框、sg RNA表達框的質(zhì)粒的構(gòu)建
        2.3.5 CRISPR-HDR系統(tǒng)中供體DNA的構(gòu)建
        2.3.6 黑曲霉CRISPR敲除fwn A基因菌株的構(gòu)建
        2.3.7 基于HPLC-MS的黑曲霉次級代謝產(chǎn)物檢測
        2.3.8 黑曲霉gox C表達轉(zhuǎn)化子中g(shù)ox C拷貝數(shù)的鑒定
        2.3.9 黑曲霉胞外蛋白濃度的測定、SDS-PAGE蛋白電泳以及Gox C酶活測定方法
    2.4 結(jié)果與討論
        2.4.1 黑曲霉CBS531.88 來源的III型啟動子的確定
        2.4.2 重組表達質(zhì)粒p FC330-An U61-fwn A和 p FC330-An U62-fwn A在對于黑曲霉CBS513.88中fwn A基因的編輯
        2.4.3 煙曲霉來源的U6-2啟動子、米曲霉來源的U6啟動子可以介導(dǎo)黑曲霉中Cas9 蛋白敲除fwn A基因
        2.4.4 體外合成sg RNA可以介導(dǎo)Cas9 蛋白突變fwn A基因
        2.4.5 CRISPR-HDR介導(dǎo)的位點特異性插入方法的建立
        2.4.6 CRISPR-HDR介導(dǎo)的超長片段敲除方法的建立
        2.4.7 CRISPR-HDR介導(dǎo)的多位點、多基因插入方法的建立
    2.5 小結(jié)
第三章 黑曲霉BHLH型轉(zhuǎn)錄因子INO2 作用機制以及其調(diào)控磷脂合成代謝的探究
    3.1 引言
    3.2 實驗材料與儀器
        3.2.1 主要儀器設(shè)備
        3.2.2 主要試劑/試劑盒
        3.2.3 載體質(zhì)粒
        3.2.4 菌種
        3.2.5 引物序列
    3.3 實驗方法
        3.3.1 菌體的培養(yǎng)
        3.3.2 質(zhì)粒圖譜以及引物設(shè)計
        3.3.3 黑曲霉ino2 敲除株/ino2 原位回補株的構(gòu)建
        3.3.4 大腸桿菌蛋白的表達純化
        3.3.5 大腸桿菌蛋白表達純化以及電泳遷移率實驗(EMSA)實驗的操作
        3.3.6 酵母雙雜交實驗操作
        3.3.7 基于UPLC-MS/MS方法的黑曲霉總磷脂中磷脂酰膽堿的檢測
    3.4 結(jié)果與討論
        3.4.1 黑曲霉中調(diào)控磷脂合成的堿性螺旋-轉(zhuǎn)角-螺旋轉(zhuǎn)錄因子ino2的確定
        3.4.2 黑曲霉An02g04350p蛋白的酵母雙雜交蛋白互作分析
        3.4.3 與野生型菌株相比,ino2的缺陷導(dǎo)致細胞PI失衡
        3.4.4 黑曲霉中ino2 基因的缺陷會增加對細胞壁干擾、DNA損傷的抗性
    3.5 小結(jié)
第四章 基于比較轉(zhuǎn)錄組學(xué)的黑曲霉BHLH型轉(zhuǎn)錄因子INO2 調(diào)控機制的研究
    4.1 引言
    4.2 實驗材料與儀器
        4.2.1 主要儀器設(shè)備
        4.2.2 主要試劑/試劑盒
        4.2.3 菌種
        4.2.4 引物序列
    4.3 實驗方法
        4.3.1 菌體的培養(yǎng)
        4.3.2 黑曲霉總RNA的提取、去基因組以及反轉(zhuǎn)錄
        4.3.3 熒光定量引物設(shè)計以及qPCR實驗
        4.3.4 RNA-seq測序
        4.3.5 RNA-seq數(shù)據(jù)的生物信息學(xué)分析
    4.4 結(jié)果與討論
        4.4.1 黑曲霉中ino2 的缺失會抑制肌醇-3-磷酸合酶ino1 的轉(zhuǎn)錄
        4.4.2 外源肌醇的添加會導(dǎo)致黑曲霉磷脂酰膽堿從頭合成途徑關(guān)鍵基因的下調(diào)
        4.4.3 WT、Δino2和INO的總RNA樣品制備與質(zhì)量控制
        4.4.4 RNA-seq測序數(shù)據(jù)的統(tǒng)計學(xué)分析
        4.4.5 ino2缺失或外源添加肌醇對黑曲霉全基因組水平表達譜影響的Go富集分析
        4.4.6 ino2 缺失或外源添加肌醇會使黑曲霉UASINO基因大部分下調(diào),使UASFAS基因大部分上調(diào)
        4.4.7 ino2 的缺失以及外源添加肌醇會使PI合成途徑相關(guān)基因下調(diào),造成PI失衡
        4.4.8 黑曲霉中PI失衡會抑制UPR相關(guān)基因筆記內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相關(guān)的降解途徑(ERAD)
        4.4.9 ino2 的缺失以及外源肌醇的添加會使黑曲霉對細胞壁損傷、DNA損傷有較強抗性
    4.5 小結(jié)
第五章 基于比較脂質(zhì)組學(xué)與轉(zhuǎn)錄組學(xué)的對磷脂穩(wěn)態(tài)失衡與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白穩(wěn)態(tài)失衡互相影響的研究
    5.1 引言
    5.2 實驗材料與儀器
        5.2.1 主要儀器設(shè)備
        5.2.2 主要試劑/試劑盒
        5.2.3 載體質(zhì)粒
        5.2.4 菌種
        5.2.5 引物序列
        5.2.6 基因敲除、回補實驗方案
    5.3 實驗方法
        5.3.1 菌體的培養(yǎng)
        5.3.2 質(zhì)粒圖譜以及引物設(shè)計
        5.3.3 黑曲霉基因缺陷株以及表達株的構(gòu)建
        5.3.4 實時熒光定量實驗
        5.3.5 RNA-seq以及測序數(shù)據(jù)的生物信息學(xué)分析
        5.3.6 基于LC/MS的非靶向脂質(zhì)組學(xué)分析
        5.3.7 表型分析
    5.4 結(jié)果與討論
        5.4.1 黑曲霉中cho2(An15g06310)、opi3(An08g00560)是脂酰乙醇胺(PE)到磷脂酰膽堿(PC)途徑關(guān)鍵基因
        5.4.2 黑曲霉PE到PC途徑合成的缺陷會導(dǎo)致細胞總磷脂穩(wěn)態(tài)失衡
        5.4.3 黑曲霉中dgk1(An02g09160)是磷脂酸(PA)合成途徑中的關(guān)鍵基因,缺失后導(dǎo)致細胞總磷脂穩(wěn)態(tài)失衡
        5.4.4 黑曲霉磷脂穩(wěn)態(tài)失衡株差異脂質(zhì)KEGG富集分析
        5.4.5 黑曲霉總磷脂穩(wěn)態(tài)失衡會導(dǎo)致細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白穩(wěn)態(tài)失衡
        5.4.6 黑曲霉總磷脂穩(wěn)態(tài)失衡株表型變化研究
        5.4.7 黑曲霉總磷脂穩(wěn)態(tài)失衡株轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析
        5.4.8 黑曲霉hac A缺陷以及hac A持續(xù)性激活表達會導(dǎo)致內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白穩(wěn)態(tài)失衡
        5.4.9 黑曲霉內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白穩(wěn)態(tài)失衡株轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析
        5.4.10 黑曲霉內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白穩(wěn)態(tài)失衡會導(dǎo)致細胞總磷脂穩(wěn)態(tài)失衡
        5.4.11 黑曲霉內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白穩(wěn)態(tài)失衡株差異脂質(zhì)KEGG富集分析
        5.4.12 五組樣品中四個脂類相關(guān)合成途徑基因的轉(zhuǎn)錄水平研究
        5.4.13 黑曲霉內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白穩(wěn)態(tài)失衡表型變化研究
    5.5 小結(jié)
結(jié)論與展望
參考文獻
附錄
攻讀博士/碩士學(xué)位期間取得的研究成果
致謝
附件


【參考文獻】：
博士論文
[1]米曲霉蛋白分泌壓力反饋調(diào)控機制研究[D]. 周斌.華南理工大學(xué) 2016
[2]黑曲霉FGSC A1279次級代謝調(diào)控研究[D]. 呂揚勇.華南理工大學(xué) 2014

碩士論文
[1]葡萄糖氧化酶在無孢黑曲霉中的高效重組表達及酶學(xué)性質(zhì)研究[D]. 羅時渝.華南理工大學(xué) 2018
[2]豬圓環(huán)病毒2型Cap蛋白基因在原核和真核系統(tǒng)中的表達研究[D]. 謝景毅.華南理工大學(xué) 2017
[3]黑曲霉來源脯氨酰蛋白酶在無孢黑曲霉SH-2中表達的研究[D]. 何攀.華南理工大學(xué) 2014
[4]黑曲霉酸性蛋白酶基因在曲霉中表達的研究[D]. 苗小康.華南理工大學(xué) 2010



本文編號：3653044