黑曲霉被廣泛應用于商用蛋白的生產,但是針對黑曲霉的遺傳操作工具卻比較單一化。傳統(tǒng)的同源重組系統(tǒng)有著操作簡便、適用范圍廣的特點,但是其效率普遍偏低,因此一套操作簡便而且效率高的遺傳操作工具亟待開發(fā)。黑曲霉具有強大的胞外蛋白分泌能力,但是異源蛋白在黑曲霉中的分泌表達能力卻不盡人意。對其限制因素的分析表明,異源蛋白基因的轉錄以及m RNA穩(wěn)定性水平總體上是令人滿意的,其生產瓶頸主要存在于內質網中蛋白翻譯后分泌途徑中的修飾過程。磷脂作為內質網的主要成分,對內質網的形態(tài)、體積、功能有重要的影響。釀酒酵母中報道過主要調控磷脂代謝的轉錄因子ino2/ino4除了對磷脂代謝調控有主導作用,進而影響內質網的功能,也會影響內質網蛋白加工穩(wěn)態(tài)環(huán)境。然而在黑曲霉中,關于磷脂代謝的轉錄調控研究得卻是少之又少。內質網磷脂穩(wěn)態(tài)失衡會造成脂質雙層成分的擾動,進而影響內質網的形態(tài),這種變化可以獨立于UPR壓力而激活內質網的UPR效應。同時,蛋白分泌途徑中UPR信號機制除了作為內質網壓力的應答途徑,促進控制胞內蛋白質量控制與動態(tài)平衡外,UPR調控基因中也包含許多與磷脂代謝相關的功能基因。內質網的蛋白穩(wěn)態(tài)與磷脂代謝穩(wěn)態(tài)有某... 

【文章頁數(shù)】：198 頁

【學位級別】：博士

【文章目錄】：
摘要
abstract
第一章 緒論
    1.1 黑曲霉基因編輯系統(tǒng)
        1.1.1 黑曲霉基因編輯系統(tǒng)發(fā)展概述
        1.1.2 絲狀真菌中CRISPR/Cas9 系統(tǒng)的應用現(xiàn)狀
        1.1.3 黑曲霉中CRISPR系統(tǒng)目前所面臨的一些問題
    1.2 黑曲霉蛋白合成分泌與內質網UPR機制的關系
        1.2.1 黑曲霉蛋白分泌途徑概述
        1.2.2 絲狀真菌內質網的UPR效應機制
        1.2.3 內質網UPR機制在絲狀真菌蛋白生產中的應用
    1.3 真菌內質網UPR效應與膜結構相互影響
        1.3.1 真菌內質網結構概述
        1.3.2 內質網脂質的擾動可以激活內質網UPR效應
        1.3.3 真菌磷脂相關代謝物的擾動可以激活UPR效應
    1.4 真菌磷脂合成機制
        1.4.1 真菌磷脂合成途徑
        1.4.2 真菌磷脂合成的遺傳調控
        1.4.3 肌醇對于真核微生物磷脂合成的調控
        1.4.4 磷脂代謝調控與內質網壓力誘導UPR效應的關系
    1.5 本課題的研究意義以及主要內容
        1.5.1 本課題的研究意義
        1.5.2 本課題的研究內容
第二章 基于CRISPR-HDR技術的黑曲霉基因的大片段敲除以及多片段、多拷貝插入平臺的建立
    2.1 引言
    2.2 實驗材料與儀器
        2.2.1 主要儀器設備
        2.2.2 主要試劑/試劑盒
        2.2.3 質粒載體
        2.2.4 菌種
        2.2.5 培養(yǎng)基配方
        2.2.6 引物序列
    2.3 實驗方法
        2.3.1 菌體的培養(yǎng)
        2.3.2 黑曲霉CRISPR敲除fwn A基因的sg RNA表達質粒的構建
        2.3.3 黑曲霉體外轉錄合成sgRNA
        2.3.4 包含Cas9 蛋白表達框、sg RNA表達框的質粒的構建
        2.3.5 CRISPR-HDR系統(tǒng)中供體DNA的構建
        2.3.6 黑曲霉CRISPR敲除fwn A基因菌株的構建
        2.3.7 基于HPLC-MS的黑曲霉次級代謝產物檢測
        2.3.8 黑曲霉gox C表達轉化子中gox C拷貝數(shù)的鑒定
        2.3.9 黑曲霉胞外蛋白濃度的測定、SDS-PAGE蛋白電泳以及Gox C酶活測定方法
    2.4 結果與討論
        2.4.1 黑曲霉CBS531.88 來源的III型啟動子的確定
        2.4.2 重組表達質粒p FC330-An U61-fwn A和 p FC330-An U62-fwn A在對于黑曲霉CBS513.88中fwn A基因的編輯
        2.4.3 煙曲霉來源的U6-2啟動子、米曲霉來源的U6啟動子可以介導黑曲霉中Cas9 蛋白敲除fwn A基因
        2.4.4 體外合成sg RNA可以介導Cas9 蛋白突變fwn A基因
        2.4.5 CRISPR-HDR介導的位點特異性插入方法的建立
        2.4.6 CRISPR-HDR介導的超長片段敲除方法的建立
        2.4.7 CRISPR-HDR介導的多位點、多基因插入方法的建立
    2.5 小結
第三章 黑曲霉BHLH型轉錄因子INO2 作用機制以及其調控磷脂合成代謝的探究
    3.1 引言
    3.2 實驗材料與儀器
        3.2.1 主要儀器設備
        3.2.2 主要試劑/試劑盒
        3.2.3 載體質粒
        3.2.4 菌種
        3.2.5 引物序列
    3.3 實驗方法
        3.3.1 菌體的培養(yǎng)
        3.3.2 質粒圖譜以及引物設計
        3.3.3 黑曲霉ino2 敲除株/ino2 原位回補株的構建
        3.3.4 大腸桿菌蛋白的表達純化
        3.3.5 大腸桿菌蛋白表達純化以及電泳遷移率實驗(EMSA)實驗的操作
        3.3.6 酵母雙雜交實驗操作
        3.3.7 基于UPLC-MS/MS方法的黑曲霉總磷脂中磷脂酰膽堿的檢測
    3.4 結果與討論
        3.4.1 黑曲霉中調控磷脂合成的堿性螺旋-轉角-螺旋轉錄因子ino2的確定
        3.4.2 黑曲霉An02g04350p蛋白的酵母雙雜交蛋白互作分析
        3.4.3 與野生型菌株相比,ino2的缺陷導致細胞PI失衡
        3.4.4 黑曲霉中ino2 基因的缺陷會增加對細胞壁干擾、DNA損傷的抗性
    3.5 小結
第四章 基于比較轉錄組學的黑曲霉BHLH型轉錄因子INO2 調控機制的研究
    4.1 引言
    4.2 實驗材料與儀器
        4.2.1 主要儀器設備
        4.2.2 主要試劑/試劑盒
        4.2.3 菌種
        4.2.4 引物序列
    4.3 實驗方法
        4.3.1 菌體的培養(yǎng)
        4.3.2 黑曲霉總RNA的提取、去基因組以及反轉錄
        4.3.3 熒光定量引物設計以及qPCR實驗
        4.3.4 RNA-seq測序
        4.3.5 RNA-seq數(shù)據(jù)的生物信息學分析
    4.4 結果與討論
        4.4.1 黑曲霉中ino2 的缺失會抑制肌醇-3-磷酸合酶ino1 的轉錄
        4.4.2 外源肌醇的添加會導致黑曲霉磷脂酰膽堿從頭合成途徑關鍵基因的下調
        4.4.3 WT、Δino2和INO的總RNA樣品制備與質量控制
        4.4.4 RNA-seq測序數(shù)據(jù)的統(tǒng)計學分析
        4.4.5 ino2缺失或外源添加肌醇對黑曲霉全基因組水平表達譜影響的Go富集分析
        4.4.6 ino2 缺失或外源添加肌醇會使黑曲霉UASINO基因大部分下調,使UASFAS基因大部分上調
        4.4.7 ino2 的缺失以及外源添加肌醇會使PI合成途徑相關基因下調,造成PI失衡
        4.4.8 黑曲霉中PI失衡會抑制UPR相關基因筆記內質網相關的降解途徑(ERAD)
        4.4.9 ino2 的缺失以及外源肌醇的添加會使黑曲霉對細胞壁損傷、DNA損傷有較強抗性
    4.5 小結
第五章 基于比較脂質組學與轉錄組學的對磷脂穩(wěn)態(tài)失衡與內質網蛋白穩(wěn)態(tài)失衡互相影響的研究
    5.1 引言
    5.2 實驗材料與儀器
        5.2.1 主要儀器設備
        5.2.2 主要試劑/試劑盒
        5.2.3 載體質粒
        5.2.4 菌種
        5.2.5 引物序列
        5.2.6 基因敲除、回補實驗方案
    5.3 實驗方法
        5.3.1 菌體的培養(yǎng)
        5.3.2 質粒圖譜以及引物設計
        5.3.3 黑曲霉基因缺陷株以及表達株的構建
        5.3.4 實時熒光定量實驗
        5.3.5 RNA-seq以及測序數(shù)據(jù)的生物信息學分析
        5.3.6 基于LC/MS的非靶向脂質組學分析
        5.3.7 表型分析
    5.4 結果與討論
        5.4.1 黑曲霉中cho2(An15g06310)、opi3(An08g00560)是脂酰乙醇胺(PE)到磷脂酰膽堿(PC)途徑關鍵基因
        5.4.2 黑曲霉PE到PC途徑合成的缺陷會導致細胞總磷脂穩(wěn)態(tài)失衡
        5.4.3 黑曲霉中dgk1(An02g09160)是磷脂酸(PA)合成途徑中的關鍵基因,缺失后導致細胞總磷脂穩(wěn)態(tài)失衡
        5.4.4 黑曲霉磷脂穩(wěn)態(tài)失衡株差異脂質KEGG富集分析
        5.4.5 黑曲霉總磷脂穩(wěn)態(tài)失衡會導致細胞內質網蛋白穩(wěn)態(tài)失衡
        5.4.6 黑曲霉總磷脂穩(wěn)態(tài)失衡株表型變化研究
        5.4.7 黑曲霉總磷脂穩(wěn)態(tài)失衡株轉錄組學分析
        5.4.8 黑曲霉hac A缺陷以及hac A持續(xù)性激活表達會導致內質網蛋白穩(wěn)態(tài)失衡
        5.4.9 黑曲霉內質網蛋白穩(wěn)態(tài)失衡株轉錄組學分析
        5.4.10 黑曲霉內質網蛋白穩(wěn)態(tài)失衡會導致細胞總磷脂穩(wěn)態(tài)失衡
        5.4.11 黑曲霉內質網蛋白穩(wěn)態(tài)失衡株差異脂質KEGG富集分析
        5.4.12 五組樣品中四個脂類相關合成途徑基因的轉錄水平研究
        5.4.13 黑曲霉內質網蛋白穩(wěn)態(tài)失衡表型變化研究
    5.5 小結
結論與展望
參考文獻
附錄
攻讀博士/碩士學位期間取得的研究成果
致謝
附件


【參考文獻】：
博士論文
[1]米曲霉蛋白分泌壓力反饋調控機制研究[D]. 周斌.華南理工大學 2016
[2]黑曲霉FGSC A1279次級代謝調控研究[D]. 呂揚勇.華南理工大學 2014

碩士論文
[1]葡萄糖氧化酶在無孢黑曲霉中的高效重組表達及酶學性質研究[D]. 羅時渝.華南理工大學 2018
[2]豬圓環(huán)病毒2型Cap蛋白基因在原核和真核系統(tǒng)中的表達研究[D]. 謝景毅.華南理工大學 2017
[3]黑曲霉來源脯氨酰蛋白酶在無孢黑曲霉SH-2中表達的研究[D]. 何攀.華南理工大學 2014
[4]黑曲霉酸性蛋白酶基因在曲霉中表達的研究[D]. 苗小康.華南理工大學 2010



本文編號：3653044