黑曲霉（Aspergillus niger）,一種在自然界普遍存在的絲狀真菌,因其可以產(chǎn)生有機(jī)酸、酶類和多種次級(jí)代謝產(chǎn)物,故在工業(yè)生產(chǎn)中具有重要的應(yīng)用價(jià)值;同時(shí)作為一種典型的致腐真菌,能夠造成食品、植物、果蔬的腐爛變質(zhì)。外界氧化脅迫導(dǎo)致黑曲霉細(xì)胞內(nèi)活性氧（ROS）的大量積累,為抵抗ROS造成的氧化損傷,黑曲霉抗氧化系統(tǒng)中的過氧化氫酶（CAT）和超氧化物歧化酶（SOD）在其中發(fā)揮著重要作用。本論文利用同源重組原理,結(jié)合原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化技術(shù),構(gòu)建黑曲霉ΔcpeB、ΔcatA、ΔcpeB-ΔcatA和ΔcpeB-ΔsodC缺失體,以探究黑曲霉中cpeB和catA基因?qū)ρ趸瘧?yīng)激和果實(shí)致病性的調(diào)控機(jī)制。主要研究結(jié)果如下:首先,對(duì)過氧化氫酶-過氧化物酶編碼基因cpeB在氧化應(yīng)激和對(duì)果實(shí)的致病力中的作用進(jìn)行了探究。鑒于cpeB基因可能參與黑曲霉的抗氧化代謝過程,利用RT-qPCR技術(shù)對(duì)cpeB基因在氧化應(yīng)激反應(yīng)中的作用進(jìn)行探究,發(fā)現(xiàn)在外源H₂O₂脅迫下,黑曲霉cpeB基因的相對(duì)表達(dá)量是正常條件下的3.87倍。通過對(duì)過氧化氫酶-過氧化物酶cpeB進(jìn)行生物信息學(xué)分... 

【文章來源】：合肥工業(yè)大學(xué)安徽省211工程院校教育部直屬院校

【文章頁數(shù)】：80 頁

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【文章目錄】：
致謝
摘要
abstract
第一章 前言
    1.1 黑曲霉研究概述
    1.2 病原真菌氧化應(yīng)激和ROS的產(chǎn)生
    1.3 植物免疫防御及致病真菌的響應(yīng)機(jī)制
    1.4 真菌中過氧化氫酶和超氧化物歧化酶的研究進(jìn)展
        1.4.1 過氧化氫酶在真菌中的研究進(jìn)展
        1.4.2 超氧化物歧化酶在真菌中的研究進(jìn)展
    1.5 真菌基因工程研究進(jìn)展
    1.6 課題研究的目的、意義及內(nèi)容
        1.6.1 研究目的與意義
        1.6.2 研究內(nèi)容
第二章 黑曲霉cpeB缺失體的構(gòu)建及基因的功能研究
    2.1 實(shí)驗(yàn)材料、試劑及儀器
        2.1.1 實(shí)驗(yàn)材料
        2.1.2 主要試劑
        2.1.3 主要儀器
    2.2 實(shí)驗(yàn)方法
        2.2.1 總RNA的提取
        2.2.2 cDNA的合成
        2.2.3 引物的設(shè)計(jì)及RT-qPCR檢測
        2.2.4 黑曲霉cpeB基因的生物信息學(xué)分析
        2.2.5 黑曲霉cpeB敲除載體的構(gòu)建
        2.2.6 黑曲霉原生質(zhì)體的制備及聚乙二醇的轉(zhuǎn)化
        2.2.7 黑曲霉ΔcpeB突變體的篩選
        2.2.8 ΔcpeB突變體的鑒定
        2.2.9 黑曲霉ΔcpeB突變體過氧化氫酶(CAT)、過氧化物酶(POD)活性的檢測
        2.2.10 黑曲霉ΔcpeB突變體CAT同工酶活性電泳的檢測
        2.2.11 黑曲霉ΔcpeB突變體菌絲體生長狀況的測定
        2.2.12 黑曲霉ΔcpeB突變體生長曲線的測定
        2.2.13 不同非生物脅迫下ΔcpeB突變體的敏感性測定
        2.2.14 H_2O_2 脅迫下孢子萌發(fā)的測定
        2.2.15 MDA、H_2O_2 含量以及·O_2~-產(chǎn)生速率的測定
        2.2.16 黑曲霉侵染采后果實(shí)能力的檢測
    2.3 結(jié)果與分析
        2.3.1 H_2O_2 脅迫下黑曲霉cpeB基因的應(yīng)答
        2.3.2 黑曲霉cpeB基因的生物信息學(xué)分析
        2.3.3 黑曲霉cpeB pC3-ABCD敲除載體的構(gòu)建
        2.3.4 黑曲霉cpeB缺失體的鑒定及酶活分析
        2.3.5 黑曲霉野生型與cpeB缺失體生長狀況的比較
        2.3.6 ΔcpeB突變體對(duì)不同非生物脅迫的敏感性分析
        2.3.7 H_2O_2對(duì)ΔcpeB突變體孢子萌發(fā)的影響
        2.3.8 H_2O_2 脅迫下ΔcpeB體內(nèi)MDA、H_2O_2 含量以及·O_2~-產(chǎn)生速率的分析
        2.3.9 黑曲霉WT與 cpeB缺失體對(duì)蘋果果實(shí)的致病性分析
    2.4 本章小結(jié)
第三章 cpeB-catA雙基因突變體的構(gòu)建及其抗氧化功能和對(duì)果實(shí)的致病性研究
    3.1 實(shí)驗(yàn)材料、試劑及儀器
        3.1.1 實(shí)驗(yàn)材料
        3.1.2 主要試劑
        3.1.3 主要儀器
    3.2 實(shí)驗(yàn)方法
        3.2.1 RT-qPCR測定H_2O_2脅迫下CAT家族基因的表達(dá)量
        3.2.2 黑曲霉CAT家族基因進(jìn)化樹的構(gòu)建
        3.2.3 黑曲霉catA、An03g05660和An14g07200 敲除載體的構(gòu)建
        3.2.4 ΔcatA和 ΔcpeB-ΔcatA突變體的鑒定
        3.2.5 可溶性蛋白含量的測定
        3.2.6 過氧化氫酶(CAT)同工酶活性電泳的檢測
        3.2.7 黑曲霉對(duì)不同非生物脅迫的敏感性測定
        3.2.8 掃描電子顯微鏡觀察黑曲霉菌絲形態(tài)
        3.2.9 黑曲霉野生型和突變體對(duì)果實(shí)侵染能力的測定
    3.3 結(jié)果與分析
        3.3.1 H_2O_2脅迫下CAT家族編碼基因的應(yīng)答
        3.3.2 CAT家族基因進(jìn)化樹分析
        3.3.3 catA、An03g05660、An14g07200 基因側(cè)翼片段AB、CD的擴(kuò)增及純化
        3.3.4 片段ABCD的擴(kuò)增
        3.3.5 ABCD片段和pC3 質(zhì)粒的酶切
        3.3.6 ABCD片段與pC3 質(zhì)粒的連接及鑒定
        3.3.7 ΔcpeB-ΔcatA雙基因缺失體的鑒定及酶的活性分析
        3.3.8 ΔcpeB-ΔcatA對(duì)不同非生物脅迫的敏感性分析
        3.3.9 H_2O_2 對(duì)黑曲霉菌絲超顯微形態(tài)的影響
        3.3.10 ΔcpeB-ΔcatA對(duì)采后水果的致病性分析
    3.4 本章小結(jié)
第四章 cpeB-sodC雙突的構(gòu)建及其對(duì)黑曲霉抗氧化能力的影響
    4.1 實(shí)驗(yàn)材料、試劑及儀器
        4.1.1 實(shí)驗(yàn)材料
        4.1.2 主要試劑
        4.1.3 主要儀器
    4.2 實(shí)驗(yàn)方法
        4.2.1 ΔcpeB-ΔsodC雙突變體的篩選及鑒定
        4.2.2 超氧化物歧化酶(SOD)同工酶活性電泳的檢測
        4.2.3 ΔcpeB-ΔsodC對(duì)不同非生物脅迫的耐受力測定
        4.2.4 甲萘醌脅迫下SOD家族基因的表達(dá)水平的測定
    4.3 結(jié)果與分析
        4.3.1 ΔcpeB-ΔsodC缺失體的鑒定及酶活分析
        4.3.2 ΔcpeB-ΔsodC對(duì)不同非生物脅迫的耐受力分析
        4.3.3 黑曲霉野生型和ΔsodC中 SOD家族編碼基因?qū)纵刘{迫的應(yīng)激響應(yīng)
    4.4 本章小結(jié)
結(jié)論
參考文獻(xiàn)
攻讀碩士學(xué)位期間的學(xué)術(shù)活動(dòng)及成果情況


【參考文獻(xiàn)】：
碩士論文
[1]石榴腐爛病害綜合防治技術(shù)研究及病原菌的分離鑒定[D]. 付娟妮.西北農(nóng)林科技大學(xué) 2005



本文編號(hào)：3643966