構(gòu)建脂肪特異性蛋白27（Fat-specific protein of 27,Fsp27）基因沉默載體,研究沉默F(xiàn)sp27基因表達(dá)對3T3-L1細(xì)胞脂解的影響,并對其作用機(jī)制進(jìn)行探究。采用RNAi技術(shù),構(gòu)建Fsp27基因真核干擾載體,下調(diào)Fsp27基因的表達(dá)。"雞尾酒"法誘導(dǎo)3T3-L1前脂肪細(xì)胞分化為成熟脂肪細(xì)胞。脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染脂肪細(xì)胞,油紅O染色脂滴,酶法測定細(xì)胞中甘油及甘油三酯的含量。Western blot法檢測細(xì)胞中Fsp27、HSL、ATGL和PPARγ的蛋白表達(dá)。Western blot結(jié)果顯示:陽性sh-Fsp27干擾載體均能有效下調(diào)Fsp27的表達(dá),且伴隨細(xì)胞內(nèi)ATGL和PPARγ的表達(dá)量升高（P<0.05）,其中sh-Fsp27-2的沉默效果最好;酶學(xué)方法檢測結(jié)果顯示:陽性sh-Fsp27干擾組細(xì)胞中甘油三酯含量下降,甘油含量升高（P<0.05）;油紅O染色結(jié)果發(fā)現(xiàn):空白對照組與陰性對照組均有大脂滴堆積,陽性sh-Fsp27組小脂滴分布廣泛,未見明顯的大脂滴。sh-Fsp27-2組基因沉默載體的沉默效果最好,Fsp27基因沉默可以加快3T3-L1細(xì)胞的脂解速... 

【文章來源】：生物技術(shù)通報. 2020,36(01)北大核心CSCD

【文章頁數(shù)】：7 頁

【部分圖文】：

sh-Fsp27質(zhì)粒序列鑒定

細(xì)胞脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染4 d后，熒光顯微鏡下觀察拍照顯示：4組紅色熒光蛋白基本表達(dá)一致，轉(zhuǎn)染效率在45%左右（圖2-A），陰性對照組和陽性sh-Fsp27干擾載體之間的轉(zhuǎn)染效果沒有顯著差異。Western blot結(jié)果顯示，與sh-Fsp27-0組和空白組比較，3個陽性干擾載體可以明顯下調(diào)Fsp27蛋白的表達(dá)量（P<0.05）（圖2-B），且在3個陽性載體中sh-Fsp27-2干擾載體下調(diào)Fsp27蛋白表達(dá)的效果最好，后續(xù)實驗以sh-Fsp27-2作為陽性組。2.4 脂肪細(xì)胞中脂滴的變化

未分化的3T3-L1前脂肪細(xì)胞呈纖維樣，胞質(zhì)內(nèi)無明顯脂滴。誘導(dǎo)分化后，細(xì)胞形態(tài)由成纖維樣變?yōu)閳A形，伴隨著胞體的增大，胞內(nèi)出現(xiàn)脂滴。油紅O將細(xì)胞中的脂質(zhì)染成紅色，普通光學(xué)顯微鏡下觀察可見，對照組與sh-Fsp27-0組脂滴生成較快，8 d時能明顯觀察到脂滴聚集，12 d可見小脂滴融合成大脂滴；陽性sh-Fsp27組均可見大量小脂滴廣泛地分布于細(xì)胞核周圍，且在12 d時仍未出現(xiàn)明顯的大脂滴（圖3）。2.5 脂肪細(xì)胞內(nèi)TG和甘油含量

【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]脂滴與線粒體相互作用的研究進(jìn)展[J]. 蒲靜,張雪琳,劉平生.  生物物理學(xué)報. 2012(02)
[2]一種調(diào)控脂解的重要蛋白——圍脂滴蛋白（Perilipin）[J]. 張利紅,張立杰,楊公社.  中國生物化學(xué)與分子生物學(xué)報. 2006(12)



本文編號：3638147