RNase D（RND）在細胞中負責多種RNA分子3’端的成熟,它廣泛存在于細菌和真核生物中。目前對來自大腸桿菌中的RNase D蛋白（Ec_RND）研究最為詳細。它有三個保守的結構域:N端參與催化的DEDD結構域和C端參與底物結合的兩個HRDC結構域。然而在眾多的RNaseD同源蛋白中,C端的HRDC結構域并不完全保守,有的同源蛋白僅保留了一個HRDC結構域,部分同源蛋白甚至僅有DEDD結構域。同時,在有的細菌中同時存在不止一個RNase D同源蛋白。目前對于這些缺少HRDC結構域的RNase D蛋白還缺乏研究,尤其是它們?nèi)绾卧谌鄙俚孜锝Y合結構域的情況下發(fā)揮酶活還并沒有合理的解釋。本課題以根癌農(nóng)桿菌（Agrobacterium tumefaciens）中的RNase D同源蛋白為目標,使用blastp在根癌農(nóng)桿菌中鑒定出了兩個在序列組成上有顯著差異的兩個RNase D 同源蛋白:Atu1 151（At_RND）和Atu4108（At_NrnC）。At_RND含有典型RND的全部3個結構域,它和大腸桿菌中的... 

【文章來源】：山東大學山東省211工程院校985工程院校教育部直屬院校

【文章頁數(shù)】：132 頁

【學位級別】：博士

【文章目錄】：
摘要
ABSTRACT
符號說明
第一章 前言
    1.1 核酸的降解機制
    1.2 核酸酶的分類
    1.3 RNase D的功能與結構研究
    1.4 NanoRNases的功能與結構研究
        1.4.1 Orn
        1.4.2 NrnA and NrnB
        1.4.3 NrnC
    1.5 本文的研究目的和內(nèi)容
第二章 At_RND和At_NrnC蛋白的表達與純化
    2.1 At_RND和At_NrnC蛋白序列的分析
        2.1.1 At_RND蛋白序列的分析
        2.1.2 At_NrnC蛋白序列的分析
        2.1.3 At_RND和At_NrnC蛋白純化片段的選取
    2.2 實驗材料
        2.2.1 菌株和載體
        2.2.2 試劑和工具酶
        2.2.3 主要儀器
        2.2.4 主要緩沖液的配制
    2.3 實驗方法
        2.3.1 分子克隆
        2.3.2 蛋白質(zhì)的分離純化
    2.4 實驗結果
        2.4.1 野生型At_NrnC蛋白的表達與純化
        2.4.2 At_RND和Ec_RND蛋白的表達與純化
        2.4.3 At_NrnC突變體蛋白的表達與純化
    2.5 本章小結
第三章 AT_RND和At_NrnC晶體的篩選和優(yōu)化
    3.1 實驗材料和方法
        3.1.1 材料
        3.1.2 試劑
        3.1.3 晶體的生長
        3.1.4 At_RND和At_NrnC晶體的初篩與優(yōu)化
    3.2 實驗結果
        3.2.1 At_RND晶體初篩和優(yōu)化
        3.2.2 At_NrnC晶體的初篩和優(yōu)化
        3.2.3 At_NrnC-Mn~(2+)晶體的優(yōu)化
    3.3 本章小結
第四章 衍射數(shù)據(jù)的收集與結構的解析
    4.1 X-ray衍射晶體學的基本原理
        4.1.1 X射線衍射
        4.1.2 蛋白質(zhì)晶體的衍射
        4.1.3 衍射數(shù)據(jù)的收集與處理
        4.1.4 搭模與結構修正
    4.2 實驗方法與結果
        4.2.1 衍射數(shù)據(jù)的收集與處理
        4.2.2 分子置換法的實施過程和結果
        4.2.3 搭模與結構修正的實施過程和結果
    4.3 本章小結
第五章 At_RND和At_NrnC的結構分析
    5.1 實驗材料
    5.2 實驗原理和方法
        5.2.1 分子篩層析色譜(Size-exclusion chromatography,SEC)
        5.2.2 分析超離(Analytical ultracentrifugation,AUC)
        5.2.3 分子動力學(Molecular dynamics,MD)
    5.3 At_RND的結構及分析
        5.3.1 At_RND的結構
        5.3.2 At_RND的活性中心
        5.3.3 At_RND表面電勢的分析
        5.3.4 At_RND的聚集態(tài)分析
    5.4 At_NrnC的結構及分析
        5.4.1 At_NrnC的結構
        5.4.2 At_NrnC的活性中心
    5.5 At NrnC聚集態(tài)的研究
        5.5.1 At_NrnC晶體堆積的分析
        5.5.2 At_NrnC的SEC分析結果
        5.5.3 At_NrnC的AUC分析結果
        5.5.4 At_NrnC的分子動力學模擬
    5.6 本章小結
第六章 At_RND和At_NrnC的功能與結構研究
    6.1 實驗材料
    6.2 實驗方法
        6.2.1 dsRNA與dsDNA的制備
        6.2.2 At_RND和At_NrnC酶活的檢測
        6.2.3 分子孔道的計算與dsDNA的docking
    6.3 實驗結果及討論
        6.3.1 At_RND和At_NrnC對RNA的活性
        6.3.2 At_RND和At_NrnC對DNA的活性
        6.3.3 At_NrnC聚集態(tài)與酶活關系的研究
        6.3.4 At_NrnC降解dsDNA的模型
        6.3.5 At_NrnC催化機理的分析
        6.3.6 At_RND與At_NrnC底物類型與結構的聯(lián)系
    6.4 本章總結
全文總結
附錄
    附錄一 晶體優(yōu)化的條件
    附錄二 GROMACS的運行參數(shù)
參考文獻
致謝
攻讀博士學位期間發(fā)表的論文
學位論文評閱及答辯情況表



本文編號：3635536