G蛋白偶聯(lián)受體（GPCRs）響應(yīng)細(xì)胞外刺激從而調(diào)節(jié)多種生理功能。重復(fù)或連續(xù)的激動(dòng)劑刺激會(huì)導(dǎo)致G蛋白異源三聚體介導(dǎo)的cAMP信號傳導(dǎo)迅速返回基礎(chǔ)水平,這是GPCR脫敏的一個(gè)非常保守的過程。該反應(yīng)涉及受體磷酸化,GPCR和G蛋白的解偶聯(lián)以及β-arrestin的結(jié)合與受體內(nèi)吞。先前的研究報(bào)道了部分激動(dòng)劑引起的GPCR脫敏作用少于完全激動(dòng)劑。值得注意的是,GPCR的脫敏反應(yīng)在調(diào)節(jié)受體激活以及GPCR靶標(biāo)藥物設(shè)計(jì)中起著至關(guān)重要的作用。然而,由部分或完全激動(dòng)劑誘導(dǎo)的GPCR脫敏在結(jié)構(gòu)方面的信息仍然十分匱乏。β2-腎上腺素能受體（β2AR）是一種典型的ClassA家族的GPCR。大量研究顯示部分激動(dòng)劑引起β2AR脫敏降低的原因是β2AR的第三細(xì)胞內(nèi)環(huán)（ICL3）和羧基末端尾部（C-tail）磷酸化減少。最近發(fā)現(xiàn)部分激動(dòng)劑沙丁胺醇引起(β2AR磷酸化的初始速率要比完全激動(dòng)劑（例如腎上腺素和異丙腎上腺素）慢,并且顯著降低受體的脫敏性,表明部分和完全激動(dòng)劑可能誘導(dǎo)了 GPCR的獨(dú)特激活構(gòu)象。本文的第一部分我們通過親和純化技術(shù)分別得到了β2腎上腺素受體和G蛋白異源三聚體,并在加入部分或完全激動(dòng)劑的條件下將... 

【文章來源】：中國科學(xué)技術(shù)大學(xué)安徽省211工程院校985工程院校

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【學(xué)位級別】：博士

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摘要
ABSTRACT
第一部分 部分激動(dòng)劑沙丁胺酵或完全激動(dòng)劑異丙腎上腺素調(diào)節(jié)β_2腎上腺素受體脫敏的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)
第1章 文獻(xiàn)背景綜述
    1.1 G蛋白偶聯(lián)受體
        1.1.1 G蛋白偶聯(lián)受體概述
        1.1.2 G蛋白偶聯(lián)受體的分類特征
        1.1.3 GPCR的藥理學(xué)意義
    1.2 G蛋白
    1.3 β_2腎上腺素受體
        1.3.1 分類與組織分布
        1.3.2 β_2AR介導(dǎo)的信號通路
        1.3.3 β_2AR的多種小分子激動(dòng)劑
        1.3.4 β_2AR的結(jié)構(gòu)信息
    1.4 β_2腎上腺素受體的脫敏機(jī)制
        1.4.1 GPCR的脫敏信號通路
        1.4.2 完全激動(dòng)劑與部分激動(dòng)劑對受體脫敏的影響
    1.5 單顆粒冷凍電鏡技術(shù)
        1.5.1 單顆粒冷凍電鏡技術(shù)的發(fā)展
        1.5.2 冷凍電子顯微技術(shù)的一般流程
        1.5.3 單顆粒三維重構(gòu)原理
        1.5.4 分辨率的革命
        1.5.5 冷凍電鏡在GPCR結(jié)構(gòu)解析中的應(yīng)用
    1.6 本課題的研究意義
第2章 實(shí)驗(yàn)材料與方法
    2.1 載體和蛋白基因、克隆表達(dá)菌株
    2.2 主要實(shí)驗(yàn)儀器
    2.3 主要溶液配方
    2.4 β_2腎上腺素受體的細(xì)胞表達(dá)
        2.4.1 β_2AR重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化
        2.4.2 重組Bacmid DNA的分離提取
        2.4.3 Bacmid轉(zhuǎn)染
        2.4.4 擴(kuò)病毒
        2.4.5 β_2AR Sf9細(xì)胞的大量表達(dá)
    2.5 β_2腎上腺素受體-G蛋白三聚體復(fù)合物的純化與組裝
        2.5.1 β_2腎上腺素受體的純化
        2.5.2 Gs蛋白的表達(dá)與純化
        2.5.3 抗體Nb35的表達(dá)與純化
        2.5.4 β_2AR-Gs復(fù)合物的組裝
    2.6 電鏡樣品的制備與觀察
        2.6.1 負(fù)染樣品的制備
        2.6.2 負(fù)染樣品的電鏡觀察
        2.6.3 冷凍樣品的制備
        2.6.4 負(fù)染樣品的電鏡觀察
        2.6.5 300kV Titan krios電鏡冷凍數(shù)據(jù)收集
    2.7 冷凍電鏡數(shù)據(jù)的處理
    2.8 模型搭建與優(yōu)化
第3章 沙丁胺醇與β_2AR-Gs復(fù)合物的電鏡結(jié)構(gòu)
    3.1 沙丁胺醇與β_2AR-Gs復(fù)合物的克隆及表達(dá)純化
    3.2 負(fù)染樣品的制備與觀察
    3.3 冷凍樣品的制備與優(yōu)化
    3.4 200kV電鏡冷凍數(shù)據(jù)的小量收集
    3.5 300kV電鏡冷凍數(shù)據(jù)的收集與處理
    3.6 模型搭建
        3.6.1 模型搭建概況
        3.6.2 模型搭建的評估
    3.7 沙丁胺醇與β_2AR-Gs復(fù)合物的結(jié)構(gòu)分析
        3.7.1 沙丁胺醇與β_2AR-Gs復(fù)合物結(jié)構(gòu)概況
        3.7.2 沙丁胺醇結(jié)合口袋的結(jié)構(gòu)分析
        3.7.3 與沙美特羅結(jié)合方式的比較
        3.7.4 α-helical結(jié)構(gòu)域的構(gòu)象變化
    3.8 本章小結(jié)
第4章 異丙腎上腺素與β_2AR-Gs復(fù)合物的電鏡結(jié)構(gòu)
    4.1 異丙腎上腺素與β_2AR-Gs復(fù)合物的表達(dá)純化
    4.2 樣品狀態(tài)的初步篩查
    4.3 冷凍數(shù)據(jù)的收集與結(jié)構(gòu)計(jì)算
    4.4 模型搭建
    4.5 完全激動(dòng)劑和部分激動(dòng)劑的結(jié)合對受體脫敏的影響
        4.5.1 結(jié)構(gòu)口袋的構(gòu)象變化
        4.5.2 受體的構(gòu)象變化
        4.5.3 細(xì)胞內(nèi)環(huán)的構(gòu)象變化
    4.6 本章小結(jié)
第二部分 植物鉀離子通道KAT1內(nèi)向整流的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)
第5章 背景綜述與方法
    5.1 植物中的鉀離子通道
        5.1.1 鉀離子對植物的重要作用
        5.1.2 植物中鉀離子通道的分類與特征
    5.2 保衛(wèi)細(xì)胞中的鉀離子通道種群
    5.3 內(nèi)向整流K~+通道KAT1概況
    5.4 輔助亞基KAB1的作用
    5.5 植物鉀離子通道的結(jié)構(gòu)信息
    5.6 超極化激活鉀離子通道的機(jī)制
    5.7 實(shí)驗(yàn)材料與方法
        5.7.1 KAT1的克隆、表達(dá)與純化
        5.7.2 KAT1冷凍制樣與數(shù)據(jù)收集
        5.7.3 CHO細(xì)胞質(zhì)粒構(gòu)建、細(xì)胞培養(yǎng)及瞬時(shí)轉(zhuǎn)染
        5.7.4 CHO細(xì)胞的電生理分析
第6章 KAT1的冷凍電鏡結(jié)構(gòu)解析
    6.1 KAT1-KAB1的表達(dá)與純化
    6.2 電鏡觀察與制樣條件摸索
        6.2.1 KAT1-KAB1樣品的初步電鏡觀察
        6.2.2 輔助亞基KAB1的影響
        6.2.3 去垢劑類型和去垢劑濃度的影響
        6.2.4 初步二維分類
    6.3 KAT1冷凍數(shù)據(jù)的大量收集與計(jì)算
    6.4 模型搭建
    6.5 KAT1的結(jié)構(gòu)概況
    6.6 本章小結(jié)
第7章 總結(jié)與展望
參考文獻(xiàn)
附錄
致謝
在讀期間已發(fā)表或尚未發(fā)表的研究成果



本文編號：3628349