目的·構(gòu)建反轉(zhuǎn)錄病毒小向?qū)NA（small guide RNA,sgRNA）表達(dá)載體,用于小鼠T細(xì)胞分化調(diào)控及其基因功能的研究。方法·表達(dá)短發(fā)夾RNA（short hairpin RNA,shRNA） 的反轉(zhuǎn)錄病毒載體（MSCV-LTR-miR30-PIG,LMP）經(jīng)過(guò)Xho1和Sal1雙酶切后,回收得到反轉(zhuǎn)錄病毒載體骨架。以慢病毒sgRNA表達(dá)載體為模版,通過(guò)PCR擴(kuò)增獲得U6-sgRNA-PGK-Puro-BFP片段。利用同源重組將U6-sgRNA-PGK-Puro-BFP片段組裝進(jìn)反轉(zhuǎn)錄病毒載體骨架。為了驗(yàn)證系統(tǒng)的有效性,設(shè)計(jì)靶向Il17a、Rorc和Irf4的sgRNA序列并進(jìn)行克隆。分離Cas9轉(zhuǎn)基因小鼠CD4 T細(xì)胞分別進(jìn)行sgRNA反轉(zhuǎn)錄病毒感染,誘導(dǎo)其向Th17細(xì)胞分化。細(xì)胞因子染色,流式檢測(cè)Il17a陽(yáng)性細(xì)胞比例。2組獨(dú)立樣本數(shù)據(jù)比較采用非配對(duì)t檢驗(yàn)。結(jié)果·①成功構(gòu)建反轉(zhuǎn)錄病毒sgRNA載體。②利用反轉(zhuǎn)錄病毒載體向小鼠CD4 T細(xì)胞遞送sgRNA并實(shí)現(xiàn)Il17a基因敲除。③Rorc-sgRNA和Irf4-sgRNA陽(yáng)性群體中,Il17a陽(yáng)性群體比率顯著降低（P<... 

【文章來(lái)源】：上海交通大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版). 2020,40(12)北大核心CSCD

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【部分圖文】：

反轉(zhuǎn)錄病毒sgRNA表達(dá)載體構(gòu)建策略

反轉(zhuǎn)錄病毒包裝和NIH3T3細(xì)胞感染

為了將CRISPR/Cas9系統(tǒng)應(yīng)用于小鼠Th17細(xì)胞分化研究,實(shí)驗(yàn)首先建立了Th17細(xì)胞體外誘導(dǎo)分化系統(tǒng)。利用小鼠CD4 T細(xì)胞分選試劑盒分離Cas9轉(zhuǎn)基因小鼠初始CD4 T 細(xì)胞,流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果表明細(xì)胞純度在95% 以上(圖3)。CD4 T細(xì)胞鋪孔,觀察發(fā)現(xiàn)最先分離得到的小鼠CD4 T細(xì)胞體積較小,呈圓形。經(jīng)過(guò)3 d體外誘導(dǎo)培養(yǎng)后,細(xì)胞數(shù)目明顯變多,形態(tài)逐漸變成橢圓形或者條形。結(jié)果說(shuō)明,實(shí)驗(yàn)成功分離小鼠CD4 T細(xì)胞并可以進(jìn)行體外培養(yǎng),可進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。2.4 小鼠Th17 細(xì)胞中基因敲除


本文編號(hào)：3621475