目的·構建反轉錄病毒小向導RNA（small guide RNA,sgRNA）表達載體,用于小鼠T細胞分化調控及其基因功能的研究。方法·表達短發(fā)夾RNA（short hairpin RNA,shRNA） 的反轉錄病毒載體（MSCV-LTR-miR30-PIG,LMP）經過Xho1和Sal1雙酶切后,回收得到反轉錄病毒載體骨架。以慢病毒sgRNA表達載體為模版,通過PCR擴增獲得U6-sgRNA-PGK-Puro-BFP片段。利用同源重組將U6-sgRNA-PGK-Puro-BFP片段組裝進反轉錄病毒載體骨架。為了驗證系統的有效性,設計靶向Il17a、Rorc和Irf4的sgRNA序列并進行克隆。分離Cas9轉基因小鼠CD4 T細胞分別進行sgRNA反轉錄病毒感染,誘導其向Th17細胞分化。細胞因子染色,流式檢測Il17a陽性細胞比例。2組獨立樣本數據比較采用非配對t檢驗。結果·①成功構建反轉錄病毒sgRNA載體。②利用反轉錄病毒載體向小鼠CD4 T細胞遞送sgRNA并實現Il17a基因敲除。③Rorc-sgRNA和Irf4-sgRNA陽性群體中,Il17a陽性群體比率顯著降低（P<... 

【文章來源】：上海交通大學學報(醫(yī)學版). 2020,40(12)北大核心CSCD

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【部分圖文】：

反轉錄病毒sgRNA表達載體構建策略

反轉錄病毒包裝和NIH3T3細胞感染

為了將CRISPR/Cas9系統應用于小鼠Th17細胞分化研究,實驗首先建立了Th17細胞體外誘導分化系統。利用小鼠CD4 T細胞分選試劑盒分離Cas9轉基因小鼠初始CD4 T 細胞,流式細胞儀檢測結果表明細胞純度在95% 以上(圖3)。CD4 T細胞鋪孔,觀察發(fā)現最先分離得到的小鼠CD4 T細胞體積較小,呈圓形。經過3 d體外誘導培養(yǎng)后,細胞數目明顯變多,形態(tài)逐漸變成橢圓形或者條形。結果說明,實驗成功分離小鼠CD4 T細胞并可以進行體外培養(yǎng),可進行后續(xù)實驗。2.4 小鼠Th17 細胞中基因敲除


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