m6A是mRNA和lncRNA上一種廣泛存在的修飾,它從酵母到人等多個物種中都保守存在且其共有基序為RRm6ACH（R=G or A,H=A,C or U）[1-3]。m6A通過其核心甲基化轉移酶復合物METTL3-METTL14共轉錄產(chǎn)生[4-6],并且被去甲基化酶FTO/ALKBH5去除[2,7]。m6A可以被含有YTH結構域的家族蛋白所識別從而調控多種轉錄后過程。m6A的失調會導致多個關鍵的生物學過程失衡[8]。越來越多的證據(jù)證明了轉錄這個過程能夠調控染色質的動態(tài)變化[9,10]。但共轉錄產(chǎn)生的m6A對染色質的直接調節(jié)作用仍然未知。表觀基因組的動態(tài)變化對于基因在發(fā)育和健康生理過程中的正確表達至關重要[11-15]。其中轉錄是這個過程的核心[10,16-20]。轉錄整合了染色質結構和修飾變化帶來的細胞信號,轉錄復合物以及mRNA修飾,如共轉錄發(fā)生的m6A修飾。然而動態(tài)表觀基因組有機整合這幾方面信息的作用和機制尚未闡明,基于此,我們對組蛋白修飾與共轉錄的RNA m6A修飾進行了研究。首先,我們建立了一個篩選組蛋白修飾的報告系統(tǒng),發(fā)現(xiàn)當轉錄本上發(fā)生了m6A修飾時,對應的染色質上抑制型組... 

【文章來源】：南方醫(yī)科大學廣東省

【文章頁數(shù)】：137 頁

【學位級別】：博士

【部分圖文】：

圖１－５：?ｍ６Ａ代表性的識別蛋白功能結構域示意圖ｎ３７］

??ｍ?（Ｃ?一＊?丁?ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ）?＾??Ｔｒｕｎｃａｔｉｏｎ?ａｔ?６ｍＡ?ｓｉｔｅｓ????Ｉ?Ｐｒｅｐａｒｅ?ｃＤＮＡ?ｌｉｂｒａｒｙ??Ｐｅａｋｓ?ｏｆ?ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ?ｒｅａｄｓ?Ｉ?Ｓｕｂｊｅｃｔ?ｔｏ?ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ??ｉｎｄｉｃａｔｅ?ｒｅｇｉｏｎｓ?ｏｆ?６ｍＡ?ｙ??Ｄｅｔｅｃｔ?ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌ?６ｍＡ?ｓｉｔｅｓ??ＧＡＣ－?■■■■??￣￣?Ｍｕｔａｔｉｏｎｓ??ｃ??ＺＩＺ?Ｔｒｕｎｃａｔｉｏｎｓ??圖１－６：?ＭｅＲＩＰ和ｍｉＣＬＩＰ的示意圖【１３７］??Ａ：?ｍ６Ａ甲基化在全基因組范圍內檢測方法，ＭｅＲＩＰ和ｍｉＣＬＩＰ方法大致過程的示意圖。在??這兩種方法中，細胞ＲＮＡ被打斷進行片段化并且和識別ｍ６Ａ的抗體孵育。在ＭｅＲ［Ｐ方法??中，甲基化的ＲＮＡ通過抗體－磁珠復合物直接被免疫共沉淀下來，然后這些結合下來的甲基??化的ＲＮＡ被蛋白酶Ｋ消化下來或者通過游離的ｍ６Ａ單體競爭性洗脫下來。洗脫下來的片??段化的ＲＮＡ即可進行高通量測序。測序的ｒｅａｄｓ會在ｍ６Ａ位點附近富集，這樣可以對一個??或者多個ｍ６Ａ位點進行預測出大約］００－２００ｎｔ范圍的ｍ６Ａ?ｐｅａｋ。５’端的ＲＮＡ富集可能是??ｍ６Ａ，也可能是ｍ６Ａｍ。（ｂ）在ｍｉ－ＣＬＩＰ實驗中，在做免疫共沉淀之前，先把ｍ６Ａ抗體和甲??基化的ＲＮＡ交聯(lián)起來，這樣通過蛋白酶Ｋ消化后，甲基化的ＲＮＡ會留下一個小的交聯(lián)產(chǎn)??物，在后續(xù)逆轉錄反應時會導致甲基化位點附近發(fā)生截斷或者突變，然后擴增產(chǎn)生的ｃＤＮＡ??進行二代測序，通過檢測測序ｒｅａｄｓ中突變和截斷位點來判斷單個ｍ６Ａ和ｍ６Ａｍ位點。??

?博士學位論文???Ａ??廣?—?￣?Ｘ??＾?ｃ〇ｎｔｒａｌ?ＱＢ?ａｔｇ?ｐ〇＂＇?Ｓ／／??｜?＜ｇ?Ｉ?－■?ｊ??１?＾?１３＾?ｍ６Ａ?／／＇ｇｎ?＾ｃ?＾ｃ?＾ｃ?ｍ／／??ｌ?ｗ?￣??Ｊ??，ｎｕｃｌｅｏｓｏｍｅ?＃?Ｈ３Ｋ９ｍｅ２?ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ?？Ｏｔｈｅｒ?ｈｉｓｔｏｎｅ?ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ?＾?ｍ６Ａ?＾?ＲＮＡ?—－？■?ＰＣＲ?ｐｒｉｍｅｒ??圖３－１：?ｍ６Ａ報告系統(tǒng)和對照報告系統(tǒng)的模式圖??Ａ：篩選能相應ｍ６Ａ的表觀修飾的報告系統(tǒng)圖，含有ｍ６Ａｍｏｔｉｆ（ＧＧＡＣ）和對照序列（ＧＧＴＣ）??的外源質粒定點整合到宿主細胞基因組中。??Ｆｉｇｕｒｅ?３－１：?Ｔｈｅ?ｓｃｈｅｍａｔｉｃ?ｏｆ?ｍ６Ａ?ｒｅｐｏｒｔｅｒ?ａｎｄ?ｃｏｎｔｒｏｌ?ｒｅｐｏｒｔｅｒ??Ａ：?Ｓｃｈｅｍａｔｉｃ?ｏｆ?ｅｐｉｇｅｎｅｔｉｃ?ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ?ｓｙｓｔｅｍ?ｔｏ?ｍｏｎｉｔｏｒ?ｒｅｓｐｏｎｓｅ?ｔｏ?ｍ６Ａ．?Ｐｌａｓｍｉｄｓ?ｗｉｔｈ?ｅｉｔｈｅｒ??ＧＧＡＣ?（ｍ６Ａ?ｃｏｎｓｅｎｓｕｓ?ｍｏｔｉｆ）?ｏｒ?ＧＧＴＣ?（ｃｏｎｔｒｏｌ?ｍｏｔｉｆ）?ｗｅｒｅ?ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ?ｉｎｔｏ?Ｆｌｐ－Ｉｎ?ＨＥＫ２９３?ｃｅｌｌｓ．??然后對這兩株單克隆細胞進行檢測（３－２Ａ，?２Ｂ），證明其插入序列確實在ＦＲＴ??定點插入的位置，而排除隨機插入的可能；通過ＤＮＡ凝膠電泳結果可以看出來，??定點陽性引物在兩個報告組中都能檢測到陽性條帶（３－２Ａ），而表達質粒原始引??物在兩個報告組中均位陰性，說明沒有隨機插入（３－２Ｂ）；然后對這兩株細胞進??行ｄｏ

【參考文獻】：
期刊論文
[1]Recruitment and reinforcement: maintaining epigenetic silencing[J]. Chengzhi Wang,Bing Zhu,Jun Xiong.  Science China（Life Sciences）. 2018(05)



本文編號：3613986