黑水虻Hermetia illucens幼蟲是重要的資源昆蟲。一方面幼蟲可以轉(zhuǎn)化多種有機(jī)廢棄物,另一方面幼蟲富含脂質(zhì)和蛋白質(zhì),可用作畜禽養(yǎng)殖和水產(chǎn)養(yǎng)殖的優(yōu)質(zhì)飼料。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)黑水虻幼蟲可以在高濃度的重金屬環(huán)境中存活,因而可利用黑水虻來(lái)處理重金屬污染的有機(jī)廢棄物,如畜禽養(yǎng)殖場(chǎng)的糞便、重金屬污染農(nóng)田的農(nóng)作物秸稈。有關(guān)黑水虻對(duì)重金屬耐受性,人們已表征了其生物學(xué)參數(shù),但分子機(jī)制還不清楚。本研究擬從金屬硫蛋白基因的角度出發(fā),探究其在黑水虻重金屬耐受性中的作用。主要結(jié)果如下:1.黑水虻內(nèi)參基因穩(wěn)定性評(píng)價(jià)不同條件下內(nèi)參基因的穩(wěn)定性排序結(jié)果不同,在不同組織條件下EF1和Actin的穩(wěn)定性最佳;不同發(fā)育階段應(yīng)選用Actin和RPL8;不同性別應(yīng)選用Tubulin和RPL8。通過(guò)綜合6個(gè)條件下的內(nèi)參基因表達(dá)情況及Ref Finder計(jì)算結(jié)果,Actin和RP49的穩(wěn)定性綜合排名最高。2.黑水虻MT基因序列及表達(dá)模式分析從黑水虻幼蟲轉(zhuǎn)錄組中克隆得到三個(gè)金屬硫蛋白基因（BSFMT1、BSFMT2A和BSFMT2B）的c DNA序列。表達(dá)模式分析表明BSFMT1在整個(gè)幼蟲階段低表達(dá),但在成蟲與脂肪體中高表達(dá)。... 

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【學(xué)位級(jí)別】：碩士

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黑水虻MT基因重組選用的酶切位點(diǎn)（黑色三角標(biāo)示）

華中農(nóng)業(yè)大學(xué)2020屆碩士研究生學(xué)位（畢業(yè)）論文16表2-4黑水虻MT基因原核表達(dá)引物Table2-4PrimerforheterologousgeneexpressionofBSFMT圖2-2pET-42a克隆載體結(jié)構(gòu)圖Fig.2-2ThestructureofpET-42avector注:本研究中選用的兩個(gè)酶切位點(diǎn)由三角符號(hào)標(biāo)注（SpeI和XhoI）�；騁ene引物序列(5’-3’)Primersequence(5’-3’)BSFMT1F:CATGACTAGTATGCCTTGTCCGGGATGTR:CTCACTCGAGTCAATCCTTCCTTCCTTGGCBSFMT2AF:CATGACTAGTATGGGTTGTCCAAAGTGR:CTCACTCGAGTTATTTACAGCATTTCTCTTTTBSFMT2BF:CATGACTAGTATGCCCTGCGGAGGTTR:CTCACTCGAGTCACTTCCCTTTGCAGCATT

華中農(nóng)業(yè)大學(xué)2020屆碩士研究生學(xué)位（畢業(yè)）論文22RT-qPCR分析8個(gè)候選內(nèi)參基因在6種不同條件下的表達(dá)模式（Ct值對(duì)應(yīng)內(nèi)參基因的表達(dá)水平）。Ct值范圍為16.96（GAPDH）到36.95（TBP），其中絕大部分Ct值在19到26之間。在這些基因中，RPL8（22.86），Actin（22.94）和RP49（22.10）是表達(dá)量最豐富的基因，在23個(gè)循環(huán)后就達(dá)到了熒光閾值，TBP（30.21）的表達(dá)水平最低（圖3-1）。圖3-1所有樣品中內(nèi)參基因的Ct值Fig.3-1Ctvaluesofcandidatereferencegenesintotalsamples3.1.2候選內(nèi)參基因的穩(wěn)定性分析為了分析內(nèi)參基因在不同條件下的穩(wěn)定性，將6個(gè)條件分為了生物學(xué)條件和非生物學(xué)條件兩種，其中生物學(xué)條件包括不同發(fā)育階段、不同組織和不同性別，非生物學(xué)條件包括不同濃度重金屬、不同濃度抗生素、不同食物。首先對(duì)于不同發(fā)育階段條件下，NormFinder的評(píng)估結(jié)果從高到低排名為：Actin、RPL8、Tubulin、GAPDH、EF1、ATP6V1A、RP49、TBP；BestKeeper的評(píng)估結(jié)果從高到低排名為：RP49、Tubulin、RPL8、GAPDH、Actin、TBP、ATP6V1A、EF1；geNorm的評(píng)估結(jié)果從高到低排名為：ATP6V1A=GAPDH、Actin、EF1、Tubulin、RPL8、RP49以及TBP；ΔCt的評(píng)估結(jié)果從高到低排名為：Actin、Tubulin、RPL8、GAPDH、EF1、ATP6V1A、RP49以及TBP（表3-1）。通過(guò)綜合以上四種軟件的分析結(jié)果，RefFinder結(jié)果表明Actin、Tubulin和GAPDH三個(gè)內(nèi)參基因在生物學(xué)條件下穩(wěn)定性排名前三，其中Actin在不同發(fā)育條件下的穩(wěn)定性最好，TBP的穩(wěn)定性最差（圖3-2A）。


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